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CD34+造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)染神器：ProteanFect Max
閱讀：271發(fā)布時(shí)間：2025-1-15
CD34+造血干細(xì)胞是血液系統(tǒng)中的關(guān)鍵細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能。通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)，可以研究基因功能并開(kāi)發(fā)新的治療策略。ProteanFect Max作為一種高效的轉(zhuǎn)染試劑，已被證明能顯著提高mRNA轉(zhuǎn)染效率，且對(duì)細(xì)胞分化影響較小。
2. 材料與方法
2.1 CD34+造血干細(xì)胞的分選
使用動(dòng)員人單采血或臍帶血，通過(guò)陽(yáng)性選擇分選試劑盒分離CD34+細(xì)胞。推薦使用Lymphoprep™（Stemcell, 07861）作為分離試劑，以及CD34 MicroBead Kit, human（Miltenyi Biotec, 130-046-702）進(jìn)行細(xì)胞分選。
2.2 培養(yǎng)基的配制
- SFEM II培養(yǎng)基（Stemcell, 09655）和StemSpan™ CC100（Stemcell, 02690）以99:1比例混合。
- 若添加抗生素，需稀釋1000倍。
- 配制完成后，培養(yǎng)基應(yīng)放置于4°C冰箱儲(chǔ)存，并盡量在1個(gè)月內(nèi)使用完。
2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代
- 分選后的CD34+細(xì)胞以300g離心5分鐘，用1 mL完·全培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)。
- 根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞重懸至105 cells/mL的密度，接種到T25培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)板中。
- 3天后補(bǔ)液一次，若進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，需調(diào)整細(xì)胞密度至2×105 cells/mL，并隔天補(bǔ)液。
2.4 轉(zhuǎn)染操作
- 轉(zhuǎn)染核酸：mRNA。
- 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基：使用Opti-MEM培養(yǎng)基或無(wú)血清RPMI 1640/無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。
- 轉(zhuǎn)染體系：配置ProteanFect Max轉(zhuǎn)染體系，具體protocol需參考私戳獲取。
- 細(xì)胞準(zhǔn)備：確保細(xì)胞活率超過(guò)90%，避免反復(fù)離心。
- 轉(zhuǎn)染過(guò)程：孵育時(shí)間建議15分鐘，適當(dāng)延長(zhǎng)可提高轉(zhuǎn)染率，但可能影響細(xì)胞活力。
- 效率檢測(cè)：使用陽(yáng)性對(duì)照mRNA，轉(zhuǎn)染后5-48小時(shí)內(nèi)觀察EGFP表達(dá)。細(xì)胞活率可通過(guò)鏡下觀察、臺(tái)盼藍(lán)、AO/PI染色或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。
3. 結(jié)果
使用ProteanFect Max轉(zhuǎn)染的CD34+造血干細(xì)胞顯示出高達(dá)72.3%的mCherry+表達(dá)率，而未處理組僅為0.25%。此外，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的分化狀態(tài)未受顯著影響，CD71+CD235-細(xì)胞比例在轉(zhuǎn)染后第2天和第3天保持穩(wěn)定。
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