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Solarbio 大鼠脾臟NK細(xì)胞分離液試劑盒

一、 脾臟組織單細(xì)胞懸液的制備方法
注：A．全過(guò)程及所需試劑要求無(wú)菌環(huán)境。
B．本試劑盒中不包含膠原酶，若采用酶消化法制備單細(xì)胞懸液，請(qǐng)用戶根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室要求另購(gòu)不同類型膠原酶。
1. 剪碎法：將組織塊放入平皿后，加入少量F液及20%胎牛血清；用眼科剪將組織剪勻漿狀，加入5mL F液及20%胎牛血清；用吸管吸取組織勻漿，用100目不銹鋼濾網(wǎng)(另購(gòu))過(guò)濾到試管內(nèi)；離心沉淀1500轉(zhuǎn)/分×3 min，再用細(xì)胞清洗液清洗3次，每次以500rpm短時(shí)低速離心除去細(xì)胞碎片，以200目不銹鋼濾網(wǎng)（另購(gòu)）過(guò)濾去細(xì)胞團(tuán)塊。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107個(gè)/mL。常溫下放置, 待測(cè)細(xì)胞的活力。分離前用20%胎牛血清或樣本稀釋液懸起細(xì)胞濃度為2×108~1×109個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液備用。
2. 勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊；放入70mL組織研磨器內(nèi)，加入2mLF液及20%胎牛血清；緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)研棒，研磨勻漿；用5mLF液及20%胎牛血清沖洗研器；收集細(xì)胞懸液，經(jīng)200目不銹鋼濾網(wǎng)（另購(gòu)）過(guò)濾；離心沉淀800rpm×2min ，再用細(xì)胞清洗液洗3次，離心沉淀。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107個(gè)/mL。常溫下放置, 待測(cè)細(xì)胞的活力。分離前用20%胎牛血清或樣本稀釋液懸起細(xì)胞濃度為2×108~1×109個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液備用。
3. 酶消化法： 
A．用F液將膠原酶稀釋，終濃度為400 U/mL，于冰浴備用。 
B．取一適當(dāng)大小培養(yǎng)皿進(jìn)行操作：用鑷子夾碎動(dòng)物脾臟，加入稀釋后的膠原酶，37℃消化20分鐘。 
C．以100或200目不銹鋼濾網(wǎng)（另購(gòu)）過(guò)濾，離心沉淀800prm×2min ，再用細(xì)胞清洗液洗3次，離心沉淀。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107個(gè)/mL。常溫下放置, 待測(cè)細(xì)胞的活力。分離前用20%胎牛血清或樣本稀釋液懸起細(xì)胞濃度為2×108~1×109個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液備用。
細(xì)胞計(jì)數(shù)方法: 
細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用來(lái)計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方法。一般利用計(jì)數(shù)板（血球計(jì)數(shù)板）進(jìn)行。既可用于分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)接種前計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，也可用于對(duì)培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。不論計(jì)數(shù)的對(duì)象如何，均須制備分散的細(xì)胞懸液。 
計(jì)數(shù)與計(jì)算過(guò)程 
1）在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央放置計(jì)數(shù)的蓋玻片。 
2）用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計(jì)數(shù)板凹蹧處流出懸液，蓋玻片被液體充滿為止。 
3）置顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對(duì)于壓線的細(xì)胞只計(jì)數(shù)在上線和左線者，對(duì)于細(xì)胞團(tuán)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。 
4）按下式計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液的密度： 細(xì)胞密度＝（4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4）×104個(gè)/mL×稀釋倍數(shù)
公式中乘以104 因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：
1.0mm（長(zhǎng)）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3而 1mL＝1000mm3
細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)： 
A．進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/mL，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；顯微鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，遇到2個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞團(tuán)>10％，說(shuō)明細(xì)胞分散不充分; 或細(xì)胞數(shù)<200個(gè)/10mm2或>500個(gè)/10 mm2 時(shí)，說(shuō)明稀釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液。 
B．要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。 
C．取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其是多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確； 
D．?dāng)?shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。 
E． 操作時(shí)，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑校駝t要重新計(jì)數(shù)。
二、脾臟淋巴細(xì)胞分離方法
1．取1mL脾臟細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為2×108~1×109個(gè)/mL）小心疊加在淋巴細(xì)胞分離液之上（比例為1：1），20℃±2℃，400g（約1500 轉(zhuǎn)/分），離心20 分鐘（半徑15cm 水平轉(zhuǎn)子）。
2.  此時(shí)離心管中由上下細(xì)胞分四層。層;為稀釋液層。第二層；為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層。第三層；為透明分離液層。第四層；為紅細(xì)胞層。收集第二層細(xì)胞放入含細(xì)胞清洗液4-5 毫升的試管中，充分混勻后，以500g（約1800 轉(zhuǎn)/分）離心20 分鐘。沉淀經(jīng)反復(fù)洗滌2 次即得所需淋巴細(xì)胞。
注： 提取率約為80%。
三、 注意事項(xiàng)
1. 本分離液是敏光型的，在運(yùn)輸和貯藏過(guò)程中應(yīng)在18℃-25℃避光保存，啟封后置4℃保存避免微生物污染。另外，本品為真空包裝，未啟封前置于10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
2. 待分離的組織要求新鮮，避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一定在20℃水浴箱中復(fù)溫20分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時(shí)分離效果好，且所有操作過(guò)程一定要在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
3. 由于各品牌離心機(jī)的性能不同，國(guó)內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響分離效果，用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)，調(diào)節(jié)離心的時(shí)間，摸索好的分離條件（具體分離條件各實(shí)驗(yàn)室自定）。
4. 使用無(wú)靜電反應(yīng)的離心管，推薦使用未經(jīng)過(guò)堿處理的玻璃離心管。
四、產(chǎn)品性能指標(biāo)
pH                             7.0-7.5
滲透壓                         280-340mOsmol/kg
內(nèi)毒素                         ≤0.5EU/mL
無(wú)菌                           直接接種培養(yǎng)14 天后培養(yǎng)基澄清
澄明度及不溶性顆粒物           每50mL 溶液中含10μm 以上的不溶性微粒20 粒以下，
含25μm 以上的不溶性微粒5 粒以下

Solarbio 大鼠脾臟NK細(xì)胞分離液試劑盒