Notch signaling regulates strain-mediated phenotypic switching of vascular smooth muscle cells

Keywords: Notch signaling; cardiovascular; mechanosensitive; phenotype; strain; stretch quantification; vascular smooth muscle cells.

組織生長(zhǎng)和重塑主要由細(xì)胞介導(dǎo)，機(jī)械信號(hào)在此過程中起著關(guān)鍵作用。在血管壁中，血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）是血管重塑的重要調(diào)節(jié)因子，因?yàn)樗鼈兡軌虮磉_(dá)不同的表型，即分化表型（收縮表型）和去分化表型（合成表型）。VSMCs在穩(wěn)態(tài)下表現(xiàn)出靜止的收縮表型，但能夠在血流動(dòng)力學(xué)條件發(fā)生變化時(shí)切換到合成表型以誘導(dǎo)生長(zhǎng)和重塑。VSMCs經(jīng)歷的循環(huán)應(yīng)變會(huì)影響其表型，與靜態(tài)對(duì)照相比，循環(huán)應(yīng)變時(shí)收縮表型標(biāo)志物的上調(diào)和下調(diào)都有報(bào)道。然而，應(yīng)變介導(dǎo)的VSMC表型變化的潛在機(jī)制尚未wanquan解開。

VSMCs的表型可塑性受幾種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、Hippo/yes相關(guān)蛋白和 Notch，它們?cè)絹碓奖徽J(rèn)為是機(jī)械敏感的。此外，已知Notch信號(hào)參與血管系統(tǒng)的發(fā)育、重塑和穩(wěn)態(tài)。在血管壁中，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的 Jagged1 配體與鄰近 VSMCs 的 Notch 受體結(jié)合，并以前饋方式激活 Notch 信號(hào)。這種相互作用使Notch信號(hào)通過稱為側(cè)向誘導(dǎo)的過程在VSMC層中傳播，并促進(jìn)VSMCs的分化。然而，在血管重塑的背景下，應(yīng)變和 Notch 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的相互作用如何以及在多大程度上影響 VSMC 表型尚未得到研究。

鑒于Notch在調(diào)節(jié)血管發(fā)育和適應(yīng)方面的重要作用，荷蘭埃因霍芬理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系課題組曾假設(shè)Notch信號(hào)可以直接調(diào)控VSMC表型以響應(yīng)機(jī)械應(yīng)力，該團(tuán)隊(duì)通過獲取VSMCs的合成和收縮表型，并將其循環(huán)拉伸48小時(shí)，以確定由應(yīng)變引起的表型標(biāo)記物的變化。結(jié)果表明，應(yīng)變對(duì)收縮表型 VSMCs 的應(yīng)用導(dǎo)致了其向合成表型的轉(zhuǎn)化，而Notch信號(hào)在此過程中發(fā)揮重要作用。研究成果發(fā)表在 Frontiers in Cell and Developmental Biology 期刊題為“Notch signaling regulates strain-mediated phenotypic switching of vascular smooth muscle cells"。

首先，為了闡明Notch對(duì)VSMC表型的影響，通過抑制劑DAPT抑制Notch信號(hào)，同時(shí)將VSMCs接種在固定的Jagged1配體上來激活Notch信號(hào)。實(shí)驗(yàn)觀察到，與對(duì)照組相比，在DAPT后，收縮型VSMCs中αSMA的纖維組織丟失（圖1 A），ACTA2表達(dá)普遍較低，但DAPT 處理幾乎不影響合成細(xì)胞中 ACTA2 和 KI67 的表達(dá)以及 αSMA 和 KI67 染色（圖1 A-D）。相比之下，與DAPT處理組相比，Notch信號(hào)的激活增加了合成和收縮型VSMCs的收縮特征（圖1 A、C），且Notch活化顯著降低了合成VSMCs的增殖特征（圖1 B、D）。這些觀察結(jié)果表明，Jagged1介導(dǎo)的Notch激活增加了VSMCs的收縮特性。 DAPT介導(dǎo)的Notch信號(hào)抑制降低了收縮型VSMCs中收縮蛋白的表達(dá)，盡管不顯著，這與Notch在維持VSMCs的收縮特性中的作用一致。

然后，實(shí)驗(yàn)評(píng)估了合成和收縮型 VSMCs 中 Notch 通路基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與合成 VSMCs相比，收縮 VSMCs 顯示 JAG1 的表達(dá)增加，NOTCH1 和 NOTCH2 的表達(dá)降低。Notch信號(hào)的抑制通常降低了NOTCH3和JAG1的表達(dá)，Notch信號(hào)的激活顯著增加了NOTCH3在合成和收縮VSMCs中的表達(dá)，以及JAG1在合成細(xì)胞中的表達(dá)，但NOTCH1 和 NOTCH2 的表達(dá)不受 Notch 信號(hào)抑制和激活的影響。

此外，評(píng)估Notch信號(hào)對(duì)ECM產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)與合成 VSMCs 相比，收縮型 VSMCs 顯示更多的膠原I 染色，COL1A1 和 COL3A1 水平升高。與對(duì)照組相比，DAPT 介導(dǎo)的 Notch 抑制通常導(dǎo)致所有研究的 ECM 組分的表達(dá)水平較低，相比之下，Jagged1介導(dǎo)的Notch激活增加了合成和收縮型VSMCs中所有研究的ECM組分的表達(dá)。

圖1  合成和收縮VSMCs的表征，以及Notch信號(hào)抑制和激活對(duì)VSMCs表型的影響。

接下來，為了確定應(yīng)變對(duì) VSMC 表型的影響，對(duì)合成和收縮型的 VSMCs進(jìn)行不同應(yīng)變水平的機(jī)械拉伸（1 Hz，4%），發(fā)現(xiàn)收縮型VSMCs 在 αSMA 染色水平和 ACTA2 表達(dá)水平降低，向合成表型轉(zhuǎn)變，而合成型 VSMCs 的收縮特征不受應(yīng)變的顯著影響（圖2）。施加應(yīng)變時(shí)收縮型 VSMCs 中 ACTA2 表達(dá)的降低與施加的應(yīng)變水平相關(guān)，而在合成型 VSMCs 中的表達(dá)水平未檢測(cè)到與應(yīng)變的顯著相關(guān)性（圖2 C）。

然后評(píng)估了應(yīng)變對(duì)Notch通路關(guān)鍵信號(hào)分子的影響，發(fā)現(xiàn)NOTCH1 和 NOTCH2 表達(dá)僅在收縮型 VSMCs 中對(duì)應(yīng)變有反應(yīng)，在施加應(yīng)變時(shí)水平升高；NOTCH3 和 JAG1 表達(dá)在兩種 VSMCs 表型中都受到應(yīng)變的影響，隨著應(yīng)變水平的增加而降低，這種降低在收縮型 VSMCs中更明顯。

此外，評(píng)估應(yīng)變對(duì)合成和收縮型 VSMCs 的 ECM 生成的影響，發(fā)現(xiàn)只有合成VSMCs在ECM表達(dá)方面表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)變的反應(yīng)。具體而言，合成型VSMCs中COL1A1、COL3A1、COL4A1和FN的表達(dá)水平隨應(yīng)變而降低，而收縮型VSMCs的表達(dá)水平與應(yīng)變無顯著相關(guān)性。

圖2 應(yīng)變對(duì)VSMCs表型的影響。

最后，為了闡明Notch信號(hào)在應(yīng)變介導(dǎo)的VSMC表型變化中的作用，通過DAPT抑制Notch信號(hào)，并通過Jagged1配體激活Notch信號(hào)。實(shí)驗(yàn)觀察到，合成型VSMCs的收縮特征在應(yīng)變期間幾乎沒有受到Notch信號(hào)抑制的影響。此外，當(dāng) Notch 信號(hào)受到抑制時(shí)，收縮型 VSMCs 在 αSMA 含量和組織方面轉(zhuǎn)向合成表型（圖3 A）。在兩種表型中，對(duì)照和DAPT 處理的樣本中檢測(cè)到相似的ACTA2表達(dá)（圖3 B、C）。另一方面，激活 Notch 增加了收縮標(biāo)志物的表達(dá)，并在施加應(yīng)變時(shí)部分挽救了收縮型 VSMCs的收縮特征（圖3 A）。此外，即使施加應(yīng)變，在Notch激活的合成和收縮VSMCs中，ACTA2的表達(dá)普遍高于相應(yīng)的對(duì)照和DAPT處理組（圖3 C）。這表明Notch信號(hào)在應(yīng)變介導(dǎo)的表型變化中的重要作用。

為了研究Notch信號(hào)在應(yīng)變介導(dǎo)的Notch通路基因變化中的作用，評(píng)估了合成和收縮型VSMCs中的NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和JAG1水平。在兩種表型中，NOTCH1 和 NOTCH2 的表達(dá)僅受 DAPT 介導(dǎo)的 Notch 抑制和 Jagged1 介導(dǎo)的 Notch 激活的輕微影響。另一方面，拉伸過程中的Notch激活上調(diào)了NOTCH3和JAG1在合成和收縮型VSMCs中的表達(dá)。此外，在兩種表型中，NOTCH3表達(dá)在對(duì)照組中受應(yīng)變下調(diào)，在Notch激活后不隨應(yīng)變而降低，這與觀察到Notch激活的收縮型VSMCs在拉伸過程中收縮特征的部分恢復(fù)一致。有趣的是，在 Notch 激活的合成和收縮型 VSMCs 中，JAG1 表達(dá)仍隨應(yīng)變而降低，這與Notch激活的收縮VSMCs中ACTA2水平隨應(yīng)變而降低相關(guān)。

然后，評(píng)估了Notch信號(hào)在應(yīng)變介導(dǎo)的ECM生成變化中的作用，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照水平相比，拉伸過程中DAPT介導(dǎo)的Notch抑制幾乎不影響合成和收縮型VSMCs的ECM表達(dá)。另一方面，Notch激活提高了兩種表型中所有研究的ECM蛋白的表達(dá)水平。此外，在Notch激活的合成型VSMCs中，觀察不到ECM表達(dá)的應(yīng)變依賴性，特別是COL1A1、COL3A1和FN水平。

圖3    Notch信號(hào)抑制和激活對(duì)應(yīng)變介導(dǎo)的VSMC表型變化的影響。

圖4    圖形概要。（A）由內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）啟動(dòng)的Jagged1介導(dǎo)的Notch信號(hào)通過血管壁傳播并決定血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）向收縮表型的分化。高 Jagged1-Notch3 活性導(dǎo)致 VSMCs 的收縮表型，低 Jagged1-Notch 活性與 VSMCs 的合成表型相關(guān)。（B）在這項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn) Jagged1 的誘導(dǎo)上調(diào)了 NOTCH3 和 JAG1 的表達(dá)，并增加了 VSMCs 的收縮特征。這表明Notch信號(hào)直接影響VSMC表型。（C）應(yīng)變對(duì)收縮型 VSMCs的施加下調(diào)了 NOTCH3 和 JAG1 的表達(dá)，并將收縮型 VSMCs 轉(zhuǎn)向合成表型。（D）在應(yīng)用應(yīng)變過程中Jagged1 的誘導(dǎo)部分挽救了 VSMCs 的收縮表型。因此，Notch信號(hào)在應(yīng)變介導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)化中起著重要作用。

綜上所述，該研究結(jié)果證明了Notch信號(hào)在調(diào)節(jié)應(yīng)變介導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)化中的重要性。研究表明，通過利用Notch信號(hào)和應(yīng)變之間的相互作用，可以（部分）控制VSMCs的命運(yùn)，并強(qiáng)調(diào)了Notch信號(hào)是血管治療和再生醫(yī)學(xué)中的潛在靶點(diǎn)。然而，未來應(yīng)進(jìn)一步研究Notch信號(hào)在控制VSMC命運(yùn)方面的劑量反應(yīng)性以及不同受體在調(diào)節(jié)VSMC表型和血管重塑中的不同作用，以充分了解通過機(jī)械敏感Notch通路調(diào)節(jié)VSMC表型的機(jī)會(huì)和局限性。

參考文獻(xiàn)：Karakaya C, van Turnhout MC, Visser VL, Ristori T, Bouten CVC, Sahlgren CM, Loerakker S. Notch signaling regulates strain-mediated phenotypic switching of vascular smooth muscle cells. Front Cell Dev Biol. 2022 Aug 12;10:910503. doi: 10.3389/fcell.2022.910503. PMID: 36036000; PMCID: PMC9412035.

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