Mechanical force induces macrophage-derived exosomal UCHL3 promoting bone marrow mesenchymal stem cell osteogenesis by targeting SMAD1

Keywords: Exosomes; Macrophages; Mechanical force; Orthodontic tooth movement; Osteogenesis; SMAD1; UCHL3.

正畸牙齒移動(dòng)（OTM）是由機(jī)械力誘導(dǎo)的牙槽骨重塑過(guò)程，并受局部無(wú)菌炎癥的調(diào)節(jié)，其潛在機(jī)制對(duì)解剖至關(guān)重要。巨噬細(xì)胞作為機(jī)械敏感細(xì)胞，通過(guò)分泌細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)局部炎癥在 OTM 中起著至關(guān)重要的作用。研究證明，骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）具有顯著的自我更新能力和多向分化潛能，是成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，可以直接響應(yīng)機(jī)械力并促進(jìn) OTM 期間牙槽骨的形成。因此，在機(jī)械力下巨噬細(xì)胞與BMSCs的相互串?dāng)_以促進(jìn)其成骨的過(guò)程可能是 OTM 期間機(jī)械力誘導(dǎo)牙槽骨形成的重要組成部分。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，外泌體在骨重塑微環(huán)境中介導(dǎo)了巨噬細(xì)胞和 BMSCs 之間的通訊。外泌體的雙層膜結(jié)構(gòu)能很好的保護(hù)其包被的物質(zhì)，如核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等。此外，外泌體可以直接被 BMSCs 內(nèi)吞，而不是被某些反饋機(jī)制（如細(xì)胞因子）抑制。然而，在機(jī)械力作用下，來(lái)自巨噬細(xì)胞的外泌體是否以及如何調(diào)節(jié) BMSCs 成骨以及牙槽骨形成仍然未知。

基于此，南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔正畸科及江蘇省心血管病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心的研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了深入探索，表明了機(jī)械力調(diào)節(jié)骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞（BMDM）分泌的外泌體泛素羧基末端水解酶同工酶L3（UCHL3），它通過(guò)靶向Smad同源物1（SMAD1）促進(jìn) BMSCs 成骨，從而促進(jìn) OTM 期間牙槽骨形成。研究成果發(fā)布于 Journal of Nanobiotechnology 期刊題為“Mechanical force induces macrophage-derived exosomal UCHL3 promoting bone marrow mesenchymal stem cell osteogenesis by targeting SMAD1"。

首先，為了模擬體外 OTM 期間的 BMSCs 成骨，構(gòu)建機(jī)械力反應(yīng)培養(yǎng)系統(tǒng)，其中 BMDMs 用暴露于不同的機(jī)械刺激（MS），然后收集其上清液來(lái)處理 BMSCs（圖1 a）。通過(guò) CCK-8 分析測(cè)定 BMDMs 在不同應(yīng)變水平（0.5Hz，0、5、10、15%）或持續(xù)時(shí)間（0、2、6 、10 h）影響下的活力，發(fā)現(xiàn)無(wú)論時(shí)間如何變化，10% 應(yīng)變水平下其細(xì)胞活力顯著增加，因此將其作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)變幅度。

qRT-PCR、WB及ALP 染色顯示，與其他組相比，MS（10%，6 h）-BMDMs衍生的條件培養(yǎng)基顯著增加了 BMSCs 中成骨基因（Alp、Runx2 Col1 和 Ocn）（圖1 b-e）、成骨轉(zhuǎn)錄因子RUNX2 （圖1 f、g）、ALP 水平的表達(dá)（圖1 h），且細(xì)胞外基質(zhì)礦化沉積增強(qiáng)（圖1 i）。這些結(jié)果證實(shí)了適度的機(jī)械力促進(jìn)了 BMDM-介導(dǎo)的 BMSC 成骨。

隨后，探索可能在 MS-BMDMs 上清液中介導(dǎo) BMSCs 成骨的參與者，并將重點(diǎn)放在外泌體上。TEM顯示，這些純化的囊泡具有杯狀或球形形態(tài)（圖1 J），直徑主要在 30-200 nm 之間（圖1 k）。WB 進(jìn)一步證實(shí)，這些顆粒上存在 CD63 和 TSG101 等外泌體表面標(biāo)志物（圖1 l）。此外，MS-BMDMs 的上清液具有比 BMDMs 更多的外泌體（圖1 m）。這些數(shù)據(jù)表明，這些納米顆粒是外泌體，機(jī)械力促進(jìn)了 BMDMs 衍生的外泌體的分泌。基于這些發(fā)現(xiàn)，可以推測(cè)外泌體可能是 MS-BMDMs 分泌的影響 BMSCs 成骨的關(guān)鍵介質(zhì)。

為了證實(shí)源自 MS-BMDMs 的外泌體在介導(dǎo) BMSCs 成骨中的潛在作用，用熒光染料 Dil 標(biāo)記 MS-BENDM-EXOs，并用這些外泌體處理 BMSCs 12 h，發(fā)現(xiàn)MS-BMDM-EXOs 顯著促進(jìn)了成骨基因的 mRNA 表達(dá)和 RUNX2 蛋白水平、ALP 水平和細(xì)胞外基質(zhì)礦化沉積。這表明，來(lái)自 MS-BMDMs 的外泌體促進(jìn) BMSCs 中的成骨。

圖1    機(jī)械力促進(jìn) BMDM 介導(dǎo)的 BMSCs 成骨。

接下來(lái)，為了探索 MS-BMDMs 衍生的外泌體在 OTM 期間牙槽骨形成中的作用，建立了小鼠 OTM 模型，并注射 GW4869（外泌體分泌抑制劑）。壓縮力（10 g）作用 14 天后，GW4869 顯著抑制了牙齒移動(dòng)，牙槽骨骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）顯著降低，張力側(cè)的 ALP 陽(yáng)性表面受到抑制，從而表明抑制外泌體會(huì)損害 OTM 期間牙槽骨的形成。局部注射PBS、BMDM-EXOs 和 MS-BMDM-EXOs 到負(fù)荷牙齒中，14 天后，發(fā)現(xiàn)BMDM-EXOs 處理大大提高了負(fù)荷牙齒牙槽骨的 BV/TV，并且 MS-BMDM-EXOs 進(jìn)一步增強(qiáng)了這種效果。ALP 染色結(jié)果呈現(xiàn)相同的效應(yīng)。這些結(jié)果表明，來(lái)自 MS-BMDMs 的外泌體促進(jìn)了牙齒移動(dòng)過(guò)程中牙槽骨的形成。

進(jìn)一步地，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析 MS-BMDM-EXOs 和 BMDM-EXOs 中的蛋白表達(dá)譜。在 MS-BMDM-EXOs 組的上調(diào)蛋白中，發(fā)現(xiàn)了UCHL3的富集，其參與細(xì)胞蛋白質(zhì)修飾過(guò)程。WB結(jié)果進(jìn)一步揭示，BMDMs 中的 UCHL3 蛋白水平高于 BMSCs，機(jī)械力增加了 BMDMs 和 BMDM-EXOs 中 UCHL3 的蛋白水平。因此，UCHL3 可能是 MS-BMDM-EXOs 中最重要的因子之一。

使用 TCID（UCHL3 抑制劑）處理 BMSCs，發(fā)現(xiàn)其顯著降低了成骨基因、RUNX2 蛋白（圖2 a-c）及ALP 表達(dá)水平和細(xì)胞外基質(zhì)的礦化沉積（圖2 d、e）。這表明，UCHL3 對(duì) BMSCs 的成骨至關(guān)重要。然后，使用 siUchl3 敲低 MS-BMDMs 中 Uchl3 的表達(dá)（圖2 f、g），MS-BMDM_siUchl3-EXOs 中 UCHL3 蛋白水平得到有效抑制（圖2 h），然后用 MS-BMDM_siCon-EXOs 和 MS-BMDM_siUchl3-EXOs 處理 BMSCs。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，MS-BMDM-EXOs 中 UCHL3 下調(diào)后，BMSCs 中成骨基因、RUNX2 蛋白水平顯著下調(diào)（2 i-k），ALP 水平和細(xì)胞外基質(zhì)礦化沉積也受損（圖2 l、m）。這些結(jié)果表明，UCHL3 是 MS-BMDM-EXO 介導(dǎo)的 BMSC 成骨所必需的。

為了確定UCHL3 在 OTM 期間介導(dǎo)牙槽骨形成中的作用，建立OTM 模型，并在負(fù)荷期間注射UCHL3 抑制劑 TCID 。壓縮負(fù)荷14 天，TCID 注射后牙齒移動(dòng)距離明顯減小，牙槽骨BV/TV顯著降低，張力側(cè)的 ALP 陽(yáng)性表面受到抑制。此外，siUchl3 敲低 MS-BMDM-EXOs 中的 UCHL3 表達(dá)后，負(fù)荷牙槽骨的 BV/TV 同樣降低，ALP 陽(yáng)性表面也顯著受損。這些結(jié)果表明，OTM 期間 MS-BMDM-EXO 介導(dǎo)的牙槽骨形成需要 UCHL3。

圖2   UCHL3 是 MS-BMDM-EXO 介導(dǎo)的體外 BMSC 成骨所必需的。

最后，實(shí)驗(yàn)探討了 MS-BMDM 衍生的外泌體 UCHL3 調(diào)節(jié) BMSCs 成骨的機(jī)制。據(jù)報(bào)道，UCHL3 可以與 SMAD1 相互作用，SMAD1 是一種參與 BMSC 成骨的經(jīng)典相關(guān)分子。因此，研究人員假設(shè)UCHL3 可以通過(guò)調(diào)節(jié) SMAD1 介導(dǎo) BMSC 成骨。為了驗(yàn)證 UCHL3 和 SMAD1 之間的相關(guān)性，使用 TCID 和 MS-BMDM_siUchl3-EXOs 處理 BMSCs，發(fā)現(xiàn)當(dāng) UCHL3 被敲低時(shí)，SMAD1 的蛋白水平下調(diào)（圖3 a-c）。然后，在BMSCs中過(guò)表達(dá) SMAD1，發(fā)現(xiàn)其顯著逆轉(zhuǎn)了 MS-BMDM-EXOs 中 UCHL3 抑制引起的成骨基因表達(dá)、RUNX2 蛋白（圖3 d-f）、ALP 水平和細(xì)胞外基質(zhì)礦化沉積的下調(diào)（圖3 g、h）。

那么，UCHL3 如何調(diào)節(jié) BMSCs 中 SMAD1 的功能？Alphafold 2 的蛋白質(zhì)對(duì)接結(jié)果顯示，UCHL3 可以通過(guò)氫鍵直接與 SMAD1 結(jié)合（圖3 i）。進(jìn)一步的免疫熒光和免疫共沉淀驗(yàn)證了 BMSCs 中 UCHL3 和 SMAD1 之間的相互作用（圖3 j-l）。此外，TCID 對(duì)內(nèi)源性UCHL3 的抑制提高了 BMSCs 中內(nèi)源性 SMAD1 的泛素化水平（圖3 m），這表明 UCHL3 可以通過(guò)去泛素化提高 SMAD1 蛋白的穩(wěn)定性。同時(shí)，免疫組化染色實(shí)驗(yàn)顯示，UCHL3 抑制劑 TCID 降低了牙齒移動(dòng)小鼠負(fù)荷牙槽骨中的 SMAD1 水平。這些結(jié)果表明，SMAD1 是 MS-BMDM-EXO 衍生的 UCHL3 促進(jìn) BMSCs 成骨所必需的。

圖3    MS-BMDM 衍生的外泌體 UCHL3 通過(guò)靶向 SMAD1 促進(jìn) BMSCs 成骨。

圖4    圖形概要

研究表明，機(jī)械力誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞衍生的外泌體 UCHL3 通過(guò)靶向 SMAD1 促進(jìn) BMSCs 成骨，從而促進(jìn) OTM 期間牙槽骨的形成。

總之，該研究表明，機(jī)械力可以改變巨噬細(xì)胞衍生的外泌體中的蛋白質(zhì)組成。外泌體將 UCHL3 從機(jī)械刺激的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 BMSCs，提高了 BMSCs 中的 SMAD1 水平，這有利于 BMSCs 成骨，從而促進(jìn) OTM 期間牙槽骨的形成。因此，這些發(fā)現(xiàn)從巨噬細(xì)胞衍生的外泌體調(diào)節(jié) BMSCs 成骨的角度證明了 OTM 過(guò)程中機(jī)械力誘導(dǎo)成骨的機(jī)制，這可能有助于開(kāi)發(fā)正畸治療臨床問(wèn)題的新解決方案。

參考文獻(xiàn)：Pu P, Wu S, Zhang K, Xu H, Guan J, Jin Z, Sun W, Zhang H, Yan B. Mechanical force induces macrophage-derived exosomal UCHL3 promoting bone marrow mesenchymal stem cell osteogenesis by targeting SMAD1. J Nanobiotechnology. 2023 Mar 14;21(1):88. doi: 10.1186/s12951-023-01836-z. PMID: 36915132; PMCID: PMC10012474.

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