原代細胞培養(yǎng)

一、原理
將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。
二、儀器、材料及試劑
儀器：培養(yǎng)箱（調(diào)整至37℃），培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術(shù)器械、血球計數(shù)板、離心機、水浴箱（37℃）
材料：胎鼠或新生鼠
試劑：1640培養(yǎng)基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒
三、操作步驟
（一）胰酶消化法
1、器材：將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2—3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內(nèi)（或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_內(nèi)）解剖取肝臟，置平皿中。
2、用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。
3、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1mm2），再用Hank’s液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。
4、視組織塊量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。
5、加入3—5ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。
6、靜置5—10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。
7、1000rpm，離心10分鐘，棄上清液。
8、加入Hank’s液5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。
9、加入培養(yǎng)液l—2 ml（視細胞量），血球計數(shù)板計數(shù)。
10、將細胞調(diào)整到5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移至25ml細胞培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。
   上述消化分離的方法是zui基本的方法，在該方法的基礎(chǔ)上，可進一步分離不同細胞。細胞分離的方法各實驗室不同，所采用的消化酶也不相同（如膠原酶，透明質(zhì)酶等）。
（二）組織塊直接培養(yǎng)法
自上方法第3步后，將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附與瓶底面。翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。入37℃靜置3—5小時，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37℃繼續(xù)培養(yǎng)。
四、注意事項
1、自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數(shù)可在有菌環(huán)境中進行。
2、在超凈臺中，組織細胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。
3、凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入。
五、無菌操作的幾個注意事項
1、操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
2、點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。
3、操作動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。
4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。
5、瓶子開口后要盡量保持45°斜位。
6、吸溶液的吸管等不能混用。
附：Hank’s液配方：
KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4•H2O0.06g，加H2O至 1000ml
注：Hank’s液可以高壓滅菌。4℃下保存。