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知無不“研“ | ChIP實驗基礎(chǔ)攻略

時間:2021/10/14閱讀:3663
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對一個實驗室新手來講,提到ChIP,您可能沒聽過這個詞,他的全稱叫染色質(zhì)免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation),今天就帶大家來學(xué)習(xí)一下CHIP實驗的相關(guān)知識,咱們主要從CHIP的定義、原理、步驟以及應(yīng)用以下幾點給大家分析介紹,希望能幫助大家更好的做CHIP實驗


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什么叫ChIP?
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染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)用于分析基因組中特定染色體區(qū)域中組蛋白乙酰化狀態(tài)的實驗方法,被用來研究細胞內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用。是目前確定與特定蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)的最好方法。
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ChIP的原理?
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在活細胞狀態(tài)下,通過甲醛固定DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物后,采用微球菌核酸酶(Micrococcal Nucleas)(注:早期使用的超聲已經(jīng)被淘汰了,不推薦使用)隨機切斷DNA,形成一個個一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,隨后通過抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)富集、沉淀這些小片段,然后通過對NaC、蛋白酶K解除蛋白質(zhì)和DNA的交聯(lián),分離蛋白,純化DNA,最后采用PCR檢測DNA的序列信息,獲取更多信息。


從上面的原理就可以看出,ChIP實驗步驟大致可分6步:

(1)1%甲醛處理使蛋白質(zhì)與 DNA 交聯(lián) ;

(2)細胞裂解,采用微球菌核酸酶消化形成染色質(zhì)小片段;

(3)抗原-抗體反應(yīng),促進免疫沉淀反應(yīng);

(4)NaCl、蛋白酶 K 處理,解除DNA-蛋白交聯(lián);

(5)DNA 純化回收;

(6)采用1.8%瓊脂糖凝膠電泳、RT-PCR對DNA作進一步分析。

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ChIP的一般流程
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甲醛處理細胞---收集細胞,超聲破碎---加入目的蛋白的抗體,與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合---加入ProteinA,結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物,并沉淀---對沉淀下來的復(fù)合物進行清洗,除去一些非特異性結(jié)合---洗脫,得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物---解交聯(lián),純化富集的DNA-片斷---PCR分析。

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ChIP的步驟
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基本的ChIP 實驗包括五個步驟(如下圖),分別是交聯(lián)、染色質(zhì)片段化、免疫沉淀、DNA 回收和純化以及分析 DNA。由于實驗材料的不同,可能會造成在交聯(lián)和染色質(zhì)片段化方面存在一些不同,需要不斷優(yōu)化條件,才能得到高質(zhì)量的 DNA 從而進行后續(xù)的 ChIP 分析。

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1、
交聯(lián)固定


一般采用1% formaldehyde(甲醛)室溫交聯(lián)10-30分鐘,交聯(lián)的目的是為了建立蛋白質(zhì)/DNA之間的穩(wěn)定共價連接,這個過程要注意一下幾點。(1)一定要使用新鮮甲醛溶液,因為甲醛容易被氧化,導(dǎo)致交聯(lián)不充分,在后續(xù)染色質(zhì)剪切的時候則容易破壞蛋白和DNA的共價連接。(2)交聯(lián)的時間10-30分鐘,如果研究對象為轉(zhuǎn)錄因子等豐度比較高,和DNA結(jié)合也很穩(wěn)定,交聯(lián)10min即可,如果研究對象為轉(zhuǎn)錄輔因子等豐度比較低,也不是直接與DNA結(jié)合,則適當延長交聯(lián)時間至30min。

2、
染色質(zhì)片段化


根據(jù)染色質(zhì)剪切方式的不同,目前市面上提供兩種試劑盒,酶解法和超聲法的試劑盒。


酶解法則是在交聯(lián)處理之后,加入適量的核酸酶特異性的切割核小體,將核小體切割成以1個、2個……核小體為單位的片段。到這里,有些小伙伴可能就摩拳擦掌準備接下來的免疫沉淀了,但是小優(yōu)提醒您,酶解之后,樣品并沒有*切割好,還需要經(jīng)過短暫的超聲處理,把細胞膜和核膜充分打碎,使染色質(zhì)片段*釋放出來。


如果是超聲法,則比較簡單了,調(diào)整到合適的超聲功率,將樣品超聲處理適當?shù)臅r間就好了。在這個過程中要摸索好超聲的條件,過度超聲有可能破壞染色質(zhì)完整性,會給ChIP實驗富集帶來負面影響,尤其是轉(zhuǎn)錄因子和輔因子。


3、
免疫沉淀



向樣品中加入抗體將目的蛋白和連接的DNA拉下來。這個過程中引入protein G微珠,將目的蛋白和與它結(jié)合的DNA拉下來,這個過程中或多或少也會把其他雜蛋白一起拉下來,所以接下來進行高鹽和低鹽的洗脫,去掉雜質(zhì)。

在這個過程中選擇合適的抗體對實驗結(jié)果至關(guān)重要。如果您需要做測序,則要選擇ChIP-seq級的抗體,如果只是做PCR,選擇ChIP級抗體即可。因為ChIP級抗體除了要結(jié)合*裸露的靶蛋白之外,還要結(jié)合因構(gòu)象變化被DNA遮蔽的抗原表位,而ChIP-seq則需要檢測全基因組上大量的成千上萬的基因位點。所以要嚴格選擇相應(yīng)級別的抗體。



4、
DNA 回收和純化


用蛋白酶K解交聯(lián),消化染色質(zhì)的蛋白質(zhì)組分和DNA之間的連接,然后經(jīng)過DNA純化柱對樣品進行純化。


5、
分析 DNA


純化好的DNA進行PCR或者測序分析。

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ChIP的應(yīng)用
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1
轉(zhuǎn)錄因子

利用 ChIP 檢測特定的轉(zhuǎn)錄因子在基因組中的結(jié)合位置及序列,可發(fā)現(xiàn)下游基因的順式調(diào)控元件,從而幫助完善轉(zhuǎn)錄因子參與的分子通路。

2
轉(zhuǎn)錄機制

ChIP 可用于檢測 RNA 聚合酶II以及其他轉(zhuǎn)錄組分的結(jié)合位點,從而發(fā)現(xiàn)啟動子和增強子的序列,同時也可能發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。

3
組蛋白特異性修飾位點

ChIP 研究在組蛋白密碼的發(fā)現(xiàn)和表征方面起著關(guān)鍵的作用,通過 ChIP 可發(fā)現(xiàn)組蛋白特異性修飾的水平,同時也可明確組蛋白的修飾對基因的調(diào)控作用。



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