ATCC15834 Electroporation-Competent Cell

產(chǎn)品規(guī)格 
ATCC15834 Electro：                                                   50μl/支
pCAMBIA2301（control vector，10ng/μl )：                 10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                                          -80℃（12個(gè)月）

基因型

Agrobacterium rhizogenes pRi15834 (agropine type)

ATCC15834 Electroporation-Competent Cell產(chǎn)品說(shuō)明

發(fā)根農(nóng)桿菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)農(nóng)桿菌屬(agrobacterium)的一種革蘭氏陰性土壤細(xì)菌，它能夠感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物以及個(gè)別裸子植物。ATCC15834發(fā)根農(nóng)桿菌菌株來(lái)源于ATCC（美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)/American type culture collection），為發(fā)根農(nóng)桿菌原始菌株（ wild strain），含有pRi15834農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒，具有廣泛的宿主范圍（禾本科，豆科，煙草等），特別適合對(duì)紫杉醇，青蒿等藥用植物毛狀根的誘導(dǎo)。開(kāi)發(fā)的ATCC15834電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pCAMBIA2301質(zhì)粒（卡那霉素抗性）檢測(cè)，轉(zhuǎn)化效率>10⁵ cfu/μg DNA。

常規(guī)操作方法

1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（體積不大于6ul，用試劑盒抽提，雙蒸水溶解；轉(zhuǎn)化效率較高，一次使用前做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定所加質(zhì)粒的量），用手打管底混勻，立即插入冰中，用200 μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)?；旌衔锟焖僖频诫姄舯?，蓋上杯蓋，空管保留待用。

3. 啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數(shù)為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作），將電擊杯從冰中拿出，吸水紙吸干外表面水份，快速放入電轉(zhuǎn)槽中，啟動(dòng)電擊，電擊完成快速插入冰中，加入1 ml無(wú)抗生素的TY，并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中，28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)

●ATCC15834菌株質(zhì)粒轉(zhuǎn)化相關(guān)抗生素使用濃度：

常用農(nóng)桿菌抗性： (R：抗；S：敏感。)

● YMB配方（1L）：

       Yeast extract            1g

       MgSO4·7H2O        0.2g

       K2HPO4                0.5g

       NaCl                     0.1g

       甘露醇                    10g

       補(bǔ)水到1L體積，*溶解后，調(diào)PH值到7.0，121度、20分鐘高溫滅菌

       若配制YMB固體培養(yǎng)基，則加入15g 瓊脂粉。

● TY配方（1L）：

       Tryptone                5g

       Yeast extract          3g

       補(bǔ)水到1L體積，*溶解后，121度、20分鐘高溫滅菌

       配制1M的氯化鈣水溶液，121度、20分鐘高溫滅菌

       每1L 滅菌的TY液體營(yíng)養(yǎng)液中加入10ml 無(wú)菌的1M氯化鈣水溶液即可。

       若配制TY固體培養(yǎng)基，則加入15g 瓊脂粉。

注意事項(xiàng)

1. ATCC15834生長(zhǎng)緩慢，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的ATCC15834菌涂布在含抗生素的平板上應(yīng)生長(zhǎng)72小時(shí)。

2. 加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

3. 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞中不可混入氣泡，轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量。

4. 平板上陽(yáng)性克隆密度過(guò)大時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)不足，陽(yáng)性克隆生長(zhǎng)變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量或終用于涂板的菌量。