EGY48  Chemically Competent Cell

產(chǎn)品規(guī)格 

EGY48 Competent Cell:                                       100μl/支              保存： -80℃（3個(gè)月）

pGBKT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl              保存：-80℃（12個(gè)月）

Carrier DNA (10 μg/μl)                                             100μl              保存：-20℃（12個(gè)月）

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存：    4℃（12個(gè)月）

基因型

MATα, ura3, his3, trp1, LexAop (x6)-LEU2

產(chǎn)品說(shuō)明

EGY48菌株是Clontech公司開(kāi)發(fā)的LexA系統(tǒng)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)用菌株，MATα型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證或篩庫(kù)試驗(yàn)；Transformation marker為：his3，trp1，ura3，報(bào)告基因?yàn)椋?em>LEU2；報(bào)告基因UAS (上游激活序列)來(lái)源于LexA op(x6)，只有當(dāng) Bait和 Prey互作時(shí)才能啟動(dòng) LEU2表達(dá)。EGY48-LexA酵母雙雜系統(tǒng)系統(tǒng)需要三種質(zhì)粒配套使用：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ。質(zhì)粒pLexA的篩選標(biāo)志為HIS3，用于表達(dá)DNA-BD(來(lái)自原核的202個(gè)氨基酸殘基組成的LexA蛋白)與目標(biāo)蛋白 (Bait)的融合蛋白；質(zhì)粒pB42AD的篩選標(biāo)志為T(mén)RP1，用于表達(dá)AD(來(lái)自皰疹病毒的88個(gè)氨基酸殘基組成的B42AD蛋白)與目標(biāo)蛋白 (Prey)的融合蛋白；報(bào)告質(zhì)粒p8op-LacZ的篩選標(biāo)志為URA3，報(bào)告基因?yàn)?em>LacZ，報(bào)告基因UAS來(lái)源于LexA op(x6)，只有當(dāng) Bait和 Prey互作時(shí)才能啟動(dòng) LacZ表達(dá)。EGY48感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個(gè)月，pGBKT7質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>10⁴ cfu/μg DNA。

操作方法
1. 取100 μl冰上融化的EGY48感受態(tài)細(xì)胞，依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒2-5ug，Carrier DNA（95-100度5min,快速冰浴，重復(fù)一次）10 ul ，PEG/LiAc  500ul并吸打幾次混勻，30度水浴30 分鐘（15 min時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8次混勻）。
2. 將管放42度水浴15min  （7.5 min時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8次混勻）。   
3. 5000 rpm 離心 40s 棄上清，ddH2O 400ul 重懸，離心 30s 棄上清。                       

4. ddH2O 50ul重懸，涂板,29℃培養(yǎng)48-96h。

注意事項(xiàng)

1. 感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量。

3. 同時(shí)轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。

4. EGY48酵母菌株對(duì)高溫敏感，適生長(zhǎng)溫度為27-30℃；高于31℃，生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。

5. 菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長(zhǎng)中一個(gè)常見(jiàn)現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過(guò)自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。

6. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長(zhǎng)越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48 h培養(yǎng)可見(jiàn)直徑1 mm克??；涂SD單缺平板29℃，48-60 h培養(yǎng)可見(jiàn)直徑1 mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80 h培養(yǎng)可見(jiàn)直徑1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90 h培養(yǎng)可見(jiàn)直徑1 mm克隆。