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富士膠片和光純藥株式會社 生物技術中心 福地大樹

◆前言

內毒素，是存在革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的一種脂多糖（Lipopolysaccharide），僅需微量進入血液便可引發(fā)發(fā)熱癥狀，大量存在時則表現(xiàn)出強烈的毒性，甚至導致內毒素休克和死亡^1）。鑒于革蘭氏陰性菌在環(huán)境中的廣泛分布及其可能混入生產過程，加之內毒素的耐熱性和不易滅活特性，對注射劑和醫(yī)療器械實施內毒素污染管理顯得尤為重要。近年來，隨著再生醫(yī)療、疫苗、抗體及核酸藥物等相關產品的蓬勃發(fā)展，內毒素管理在這些產品中的重要性也日益凸顯。

目前，內毒素的檢測主要依賴于利用鱟血細胞提取物凝固系統(tǒng)的鱟試劑（LAL/TAL）。然而，為了保護鱟資源、確保鱟試劑穩(wěn)定供應、減少產品批間差異及提高檢測穩(wěn)定性，各鱟試劑廠家正積極使用人工原料生產的基因重組蛋白來開發(fā)重組鱟試劑（rLAL）。

◆內毒素測試法的檢測原理

內毒素測試法是使用由鱟血細胞成分制備的鱟試劑進行內毒素檢測或定量的方法。鱟的血細胞提取物成分中存在使內毒素凝固的反應體系，這種凝固反應基于多個絲氨酸蛋白酶前體依次活化的級聯(lián)反應（圖1）。內毒素激活鱟血細胞提取物中含有的C因子，隨后活化C因子激活B因子。然后，活化B因子再激活凝固酶前體，活化的凝固酶通過水解底物凝固蛋白原，將其轉化為凝固素，形成不溶性凝膠并凝固。在鱟血細胞提取成分中還存以G因子為起點，與β-葡聚糖發(fā)生反應的級聯(lián)反應，該反應也會引起凝固反應。為實現(xiàn)內毒素的特異性檢測，需去除G因子或抑制以G因子為起點的級聯(lián)反應。

圖1 由內毒素、β-葡聚糖引起的凝固級聯(lián)反應

◆使用基因重組蛋白的重組鱟試劑（rLAL）試劑

目前已商業(yè)化的rLAL試劑有兩種，一種是重組C因子試劑（rFC），僅使用參與內毒素級聯(lián)反應三因子中的C因子；另一種是重組級聯(lián)試劑（rCR），使用與LAL試劑相同的3因子（C因子、B因子、凝固酶前體）。與rCR相比，rFC的單次檢測成本低，但是靈敏度較差，需要使用熒光底物的熒光檢測和檢測儀。而rCR的靈敏度更高，可發(fā)生顯色發(fā)應，因此和天然鱟試劑一樣可使用酶標儀進行檢測。近年來，有報告稱B因子對于內毒素的特異性有著重要作用^2）3），因此使用含有C因子、B因子和凝固酶前體的rCR來檢測內毒素具有重要意義。FUJIFILM Wako于2022年推出了rCR試劑PYROSTAR™ Neo。

◆PYROSTAR™ Neo的特點與改進

PYROSTAR™ Neo是一款高靈敏度重組級聯(lián)試劑（rCR），可定量檢測低至 0.001 EU/mL的內毒素，且操作簡單，只需將凍干粉末溶解于試驗用水即可，溶解后也具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。另一方面，由各研究機構和鱟試劑廠家組成的重組鱟試劑共同研究小組在該產品上市后實施的評估結果表明，PYROSTAR™ Neo在部分水樣中對天然內毒素的反應性低于天然鱟試劑⁴⁾。由于生產用水占內毒素檢測的比例較高，因此從安全角度來看，對天然內毒素的反應性低有待改進。針對這一問題，F(xiàn)UJIFILM Wako于2024 年 6月推出了PYROSTAR™ Neo+ 的改良版——PYROSTAR™ Neo＋。

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◆PYROSTAR™ Neo＋

重組級聯(lián)試劑（rCR）PYROSTAR™ Neo＋，不僅繼承了前代PYROSTAR™ Neo的高靈敏度、操作簡便、溶解后穩(wěn)定性優(yōu)異的特點，還提高了對天然內毒素的反應性（PYROSTAR™ Neo存在的問題）。通過對從日本全國各地采集的自來水樣品中的天然內毒素進行驗證測試，結果顯示，與PYROSTAR™ Neo相比，PYROSTAR™ Neo＋的反應性更高，且與天然鱟試劑（ES-F）具有相同的反應性（圖2）。由于生產用水占內毒素檢測的比例較高，從安全角度考慮，PYROSTAR™ Neo＋對水中內毒素的良好反應性具有重要意義。此外，PYROSTAR™ Neo＋另一大特點是在藥物檢測中，標準曲線可靠，并可檢測多種藥物。

圖2 對水中天然內毒素反應性的對比結果

◆結語

目前，天然鱟試劑仍是內毒素檢測的主流試劑，而利用人工原料合成基因重組蛋白的重組鱟試劑的歷史較短，有待進一步普及。國際上主流藥典對使用重組鱟試劑進行內毒素檢測的監(jiān)管情況如下：

· 2021年，歐洲藥典正式收錄了利用熒光法的基因重組C因子試劑（rFC）。

· 第十八版（最新版）日本藥典的參考信息中記載了“使用基因重組蛋白作為內毒素測試法和檢測試劑的替代法"。

此外，美國藥典將于2025年5月新增允許使用重組鱟試劑（rCR、rFC）進行內毒素檢測的章節(jié)，因此重組鱟試劑備受關注。這些發(fā)展可能會加速歐洲藥典追加收錄rCR，以及日本藥典對重組鱟試劑（rCR、rFC）的正式收錄。目前有關鱟試劑和重組鱟試劑的比較正在不斷推進^4）5），今后可能會持續(xù)推進重組鱟試劑的使用，但需滿足制藥企業(yè)等用戶的具體需求以推動重組鱟試劑的實際應用，從而實現(xiàn)用戶利益與環(huán)境保護（包括鱟類生物保護）的平衡。?

參考文獻

1）棚元憲一：國立醫(yī)薬品食品衛(wèi)生研究所報告, 126, 19 (2008).

2）Kobayashi,Y. et al. : J. Biol. Chem., 290, 19379 (2015).

3）Tsuchiya. M. : Int. J. Dev. Res. 10, 36751 (2020).

4）菊池裕 他：醫(yī)薬品醫(yī)療機器レギュラトリーサイエンス, 54 (4), 341 (2023).

5）菊池裕 他：醫(yī)薬品醫(yī)療機器レギュラトリーサイエンス, 48 (4), 252 (2017).

◆產品列表

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