無(wú)動(dòng)物參與的皮膚致敏試驗(yàn)方法
ADRA試劑盒
ADRA（Amino acid Derivative Reactivity Assay，氨基酸衍生物反應(yīng)法）是應(yīng)用了N-（2-（1-naphthyl） acetyl）-L-cysteine【NAC】和α-N-（2-（1-naphthyl） acetyl）-L-lysine【NAL】的化學(xué)品皮膚致敏試驗(yàn)方法，該方法無(wú)動(dòng)物參與，是動(dòng)物皮膚致敏試驗(yàn)的替代方法

無(wú)動(dòng)物參與的皮膚致敏試驗(yàn)方法

ADRA試劑盒

 

 

　　ADRA（Amino acid Derivative Reactivity Assay，氨基酸衍生物反應(yīng)法）是應(yīng)用了N-(2-(1-naphthyl) acetyl)-L-cysteine【NAC】和α-N-(2-(1-naphthyl) acetyl)-L-lysine【NAL】的化學(xué)品皮膚致敏試驗(yàn)方法，該方法無(wú)動(dòng)物參與，是動(dòng)物皮膚致敏試驗(yàn)的替代方法，符合OECD TG442C（經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織化學(xué)品 TG442C測(cè)試準(zhǔn)則）。

 

 

◆原理

 

皮膚致敏是由致敏物質(zhì)與蛋白結(jié)合形成復(fù)合物（KE1）開(kāi)始的，該復(fù)合物通過(guò)致敏物質(zhì)與蛋白中的半胱氨酸的巰基或賴氨酸的氨基的共價(jià)結(jié)合所得。ADRA試驗(yàn)利用NAC（半胱氨酸衍生物）和NAL（賴氨酸衍生物）替代蛋白，通過(guò)NAC、NAL和待測(cè)物質(zhì)的反應(yīng)來(lái)預(yù)測(cè)待測(cè)物質(zhì)與蛋白的結(jié)合性。

ADRA試驗(yàn)通過(guò)將NAC、NAL溶液與待測(cè)物溶液混合，在25°C下反應(yīng)24小時(shí)，然后用HPLC法對(duì)反應(yīng)溶液中殘留的NAC和NAL的濃度進(jìn)行定量，從而對(duì)待測(cè)物質(zhì)的皮膚致敏性進(jìn)行評(píng)估。

 

 

 

◆優(yōu)點(diǎn)

 

●　靈敏度高：在相對(duì)長(zhǎng)的波長(zhǎng)下（281 nm）檢測(cè)，可防止待測(cè)樣品和親核試劑的共洗脫。

●　沉淀少：ADRA試驗(yàn)所需反應(yīng)物的濃度僅為DPRA法的1%，可避免沉淀的產(chǎn)生。

●　重復(fù)性好：在HPLC分析前，通過(guò)添加終止液（2.5％TFA）來(lái)終止反應(yīng)，因此檢測(cè)的可重復(fù)性好。

●　高通量：ADRA試驗(yàn)使用96孔板和多通道移液器，可在短時(shí)間內(nèi)測(cè)定多個(gè)樣品。

 

 

◆試劑盒組成

 

 

試劑名稱	容量	包裝
NAC	10 mL用	2瓶
NAL	10 mL用	2瓶
NAC 緩沖液 (pH 8.0) （預(yù)混合）	300 mL用	2瓶
NAL 緩沖液 (pH 10.2) （預(yù)混合）	300 mL用	2瓶
0.01 mol/L EDTA溶液	1 mL	2瓶

 

 

 

 

◆使用方法

 

　　用水將預(yù)混合緩沖液溶解，再將NAC和NAL溶于其中，然后在96孔板與待測(cè)物反應(yīng)24小時(shí)后，通過(guò)HPLC即可進(jìn)行分析。

　　預(yù)混緩沖液、NAC和NAL都已經(jīng)按照反應(yīng)所需的量分裝好，只需進(jìn)行溶解即可用于ADRA試驗(yàn)。

 

 

◆操作視頻

 

●  緩沖液的制備

●  Day1 反應(yīng)溶液的制備 

●  Day2 反應(yīng)的終止

 

 

◆其他需要用到的試劑·實(shí)驗(yàn)器材

 

試劑

 

產(chǎn)品編號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	包裝
204-02743	Trifluoroacetic Acid 三氟.乙酸	和光特級(jí)	25 mL
015-08633	Acetonitrile 乙腈	高效液相色譜儀用	3 L
217-01031	Ultrapure Water 超純水*	超微量分析用	1 L
016-00346	Acetone 丙酮* *	試劑特級(jí)	500 mL
043-07216	Dimethyl Sulfoxide 二甲基亞砜	試劑特級(jí)	500 mL

* 蒸餾水或更高級(jí)別的水（ADRA試驗(yàn)需要使用金屬含量低的水。）

* * 請(qǐng)勿在被測(cè)物質(zhì)溶于水或乙腈時(shí)使用。

※ 需要用苯.乙醛 (CAS RN^® 122-78-1)作為陽(yáng)性對(duì)照化合物。

 

 

實(shí)驗(yàn)器材

 

●　電子天平：精.準(zhǔn)到0.1 mg

●　微量移液槍：量程為2～10 µL、10～100 µL和100～1000 µL的3種移液槍

●　12道移液器：量程為50～150 µL

●　HPLC系統(tǒng)：配套96孔用遮光自動(dòng)進(jìn)樣器，以0.3 mL/min流速進(jìn)樣

●　UV檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器（PDA檢測(cè)器）或吸光度檢測(cè)器（281 nm）

●　HPLC柱：Wakopak^® Core C18 ADRA Φ3.0 × 150 mm（粒徑：3.6 μm）（產(chǎn)品編號(hào)：233-63991）

●　HPLC柱：或同類型產(chǎn)品

●　pH計(jì)：pH可讀取到±0.01，并配套校準(zhǔn)用緩沖液

●　恒溫箱：溫度可設(shè)定為25℃

●　96孔板

●　500 mL PE瓶

●　試管混合器

●　微孔板封板膜：島津GLC封板膜（產(chǎn)品編號(hào)：568-RES001）或同類型具有高密封性和耐溶劑性的產(chǎn)品

●　微孔板振蕩器

●　微孔板離心機(jī)

 

※	ADRA中用到的所有容器或器具（HPLC組件除外），要求使用PP或PE制的一次性用品。金屬離子的混入會(huì)使NAC二聚化從而導(dǎo)致無(wú)法正確進(jìn)行評(píng)估。

 

 

◆產(chǎn)品列表

 

產(chǎn)品編號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	包裝
296-80901	ADRA Kit ADRA試劑盒	for Skin Sensitisation Test 皮膚致敏檢測(cè)用	1 kit

 

 

◆相關(guān)產(chǎn)品

 

ADRA色譜柱（http://www.muquzhou.cn/st301933/product_32397444.html）

 

 

◆相關(guān)應(yīng)用

 

皮膚致敏試驗(yàn)替代法ADRA應(yīng)用實(shí)例：使用Wakopak^® Core C18 ADRA色譜柱對(duì)"ADRA"中常見(jiàn)化合物進(jìn)行分析（http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/gories/show/156.html）