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可用于活細(xì)胞的不可逆GST抑制劑

CNBSF ＜Irreversible GST Inhibitor＞

CNBSF（2-chloro-5-nitrobenzensulfonyl fluoride）是針對(duì)谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（GST）的不可逆性抑制劑。與目前已知的作為GST抑制劑廣泛使用的利尿酸相比，抑制活性明顯更高，且因其不可逆性，可長(zhǎng)期保持GST失活。

※ 本產(chǎn)品基于名古屋大學(xué) 理科研究科 阿部洋教授的研究成果商品化而成。

※ 本產(chǎn)品僅供研究，研究以外不可使用。

添加CNBSF至HeLa細(xì)胞中不可逆地抑制細(xì)胞內(nèi)的GST后，使用用于活細(xì)胞的GST活性檢測(cè)探針DNs-Rh（#FDV-0030）觀察殘留的GST活性?？砂l(fā)現(xiàn)， CNBSF的添加顯著地抑制了細(xì)胞內(nèi)GST的酶活性。

◆GST以及抑制劑的含義

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）家族是廣泛存在于細(xì)菌和動(dòng)植物的酶家族，具有在細(xì)胞內(nèi)將疏水性外源性物質(zhì)（xenobiotics）結(jié)合到谷胱甘肽（GSH）中并轉(zhuǎn)換為GSH共軛物（GSH-conjugate）的活性。MRP（multidrug resistance-associated protein）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白積極地將GSH共軛物釋放到細(xì)胞外，有著去除雜質(zhì)的功能。因此，GST作為解毒因子，將可能成為細(xì)胞毒素的外來化合物排出細(xì)胞而起作用。

另一方面，由于大多數(shù)抗癌藥等藥物也會(huì)通過GST轉(zhuǎn)換為GSH共軛物排出細(xì)胞外，因此GST作為耐藥因子，也呈現(xiàn)出了降低藥效的負(fù)面影響。尤其是隨著癌癥的惡化，特定GST亞型（GSTP1）的表達(dá)水平增強(qiáng)，由此可推斷出癌細(xì)胞獲得了強(qiáng)耐藥性。雖然可以期待通過抑制GST活性提高抗癌藥在細(xì)胞內(nèi)的滯留性，然而迄今使用的GST抑制物質(zhì)并不完善。傳統(tǒng)的GST抑制物質(zhì)主要使用與GSH競(jìng)爭(zhēng)抑制的競(jìng)爭(zhēng)性抑制物質(zhì)。然而，盡管這些競(jìng)爭(zhēng)性抑制物質(zhì)在體外實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出色的抑制活性，但從細(xì)胞內(nèi)的情況來看，GSH濃度約為數(shù)毫摩爾便算是*濃度，在細(xì)胞內(nèi)引發(fā)競(jìng)爭(zhēng)、獲得充分的抑制效果是十分困難的。

◆新型GST抑制策略 BSF抑制劑

名古屋大學(xué)的阿部洋教授等人使用benzensulfonyl fluoride（BSF）基作為新的GST抑制策略，致力于制造在細(xì)胞內(nèi)的不可逆性抑制物質(zhì)，并在后成功開發(fā)出在活細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)出色抑制活性的CNBSF ^1）。CNBSF擁有細(xì)胞膜穿透性，進(jìn)入細(xì)胞后與GST的雜質(zhì)識(shí)別部位H-site結(jié)合。GSH與GST的G-site結(jié)合，CNBSF在GST的蛋白內(nèi)部附著到GSH上轉(zhuǎn)換為GSH共軛物（GS-5NBSF），而GS-5NBS立刻與GST的Tyr108（GSTP_1-1時(shí)）發(fā)生不可逆反應(yīng)。這個(gè)反應(yīng)使GS-BSF無法從GST上脫離，并且由于堵塞了H-site、G-site，使GST失活。與傳統(tǒng)競(jìng)爭(zhēng)性抑制物質(zhì)相比，這個(gè)方法能夠使GST不可逆性地失活，達(dá)到長(zhǎng)期抑制的效果。

◆詳細(xì)原理

■　抑制反應(yīng)機(jī)構(gòu)模型（以GSTP_1-1為例）

1.　CNBSF和GSH分別與GST的H-site、G-site結(jié)合，GST的酶活性依賴GSH的硫醇根陰離子與CNBSF反應(yīng)。

1.　CNBSF的氯離子CI^-作為離去基團(tuán)而脫離。

2.　在GST酶內(nèi)生成GS-5NBSF。

3.　在GS-5NBSF的benzensulfonyl fluoride基中GSTP_1-1與Tyr108發(fā)生羥基反應(yīng)。

4.　伴隨著氟離子F⁻的脫離，GST與GS-5NBSF通過共價(jià)鍵交聯(lián)。

◆特點(diǎn)

●　擁有膜穿透性，可用于活細(xì)胞

●　在細(xì)胞內(nèi)通過GST附著于GSH，作為GST抑制物質(zhì)發(fā)揮功能

●　因?yàn)槭遣豢赡嫘砸种莆镔|(zhì)，可長(zhǎng)期抑制。另外，不同于傳統(tǒng)的可逆性化合物，在清洗后仍然保持抑制作用

●　與已知GST抑制物質(zhì)ethacrynic acid（EA）相比，在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)高抑制活性

●　可與廣泛的GST家族反應(yīng)

●　經(jīng)質(zhì)譜確認(rèn)本產(chǎn)品與內(nèi)源性GST（GSTP1-1）共價(jià)結(jié)合

◆原著文獻(xiàn)

1. Shishido, Y., et al., ChemBioChem. (in press),

1. "A covalent inhibitor for Glutathione S-Transferase Pi (GSTP1-1) in human cells."

◆應(yīng)用實(shí)例

■　不可逆性GST抑制活性

使用GSTP_1-1重組體在體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)抑制活性。GSTP_1-1在含有0.1 mM抑制物質(zhì)的情況下于37°C反應(yīng)2小時(shí)，在有和無超濾清洗后，使用1 μM的GST活性檢測(cè)探針DNs-Rh（#FDV-0030）評(píng)價(jià)GST活性。從清洗后GST活性恢復(fù)可知，ethacrynic acid（EA）是可逆性抑制物質(zhì)，從CNBSF清洗后仍保持抑制活性來看，CNBSF對(duì)GST的抑制是不可逆的。

■　活細(xì)胞中GST的抑制活性

用胰蛋白酶脫離NCI-H522細(xì)胞使其懸浮，然后添加1 mM的抑制物質(zhì)在37°C下孵育15分鐘。用PBS清洗細(xì)胞后，添加2.5 μM DNs-Rh（#FDV-0030），在37°C下反應(yīng)1小時(shí)。然后再次使用PBS清洗細(xì)胞，去除未反應(yīng)的試劑后，用流式細(xì)胞儀（Ex 490/Em 520 nm）定量。添加了CNBSF的細(xì)胞中，GST活性幾乎*消失，而且效果更甚于EA。

■　質(zhì)譜鑒定GS-5NBSF結(jié)合位點(diǎn)

將化學(xué)合成的GS-5NBSF與純化GSTP_1-1反應(yīng)制備不可逆的加合物。質(zhì)譜處理后，通過肽片段的MS / MS分析鑒定結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果顯示，GS-5NBSF在Tyr108處結(jié)合。

◆產(chǎn)品列表

◆相關(guān)產(chǎn)品

可用于活細(xì)胞的GST活性檢測(cè)成像探針DNs-Rh

DNs-Rh是擁有膜通透性并響應(yīng)GST酶活性而發(fā)出熒光的探針。與廣泛的GST家族成員交叉，輕松觀察細(xì)胞的總GST活性。