本期為您推薦清華大學(xué)合成與系統(tǒng)生物學(xué)中心主任陳國強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表在Metabolic Engineering 上的一篇文章：Engineering low-salt growth Halomonas Bluephagenesis for cost-effective bioproduction combined with adaptive evolution 。 本研究采用常壓室溫等離子體技術(shù)(ARTP)，對(duì)藍(lán)晶鹽單胞菌進(jìn)行隨機(jī)突變，篩選得到在低鹽濃度下生長良好的菌株。對(duì)獲得的優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)PHA，實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)與成本降低的雙重增益。對(duì)比突變菌株與野生型基因型，揭示了嗜鹽宿主菌株的鹽脅迫相關(guān)基因。
聚羥基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHA）是細(xì)菌中用于能量儲(chǔ)存的聚合物，可開發(fā)為綠色生物降解型塑料。其具備化工塑料的物化特性，但又有生物可降解性、生物相容性、光學(xué)活性、氣體相隔性等一系列性質(zhì)。PHA生產(chǎn)菌株嗜鹽性單胞菌TD01是從中國新疆艾丁格爾湖分離的一種嗜鹽菌，在高pH和高鹽濃度下可在非無菌條件下快速生長。盡管現(xiàn)在已經(jīng)在如表達(dá)載體與啟動(dòng)子等方面對(duì)藍(lán)晶鹽單胞菌進(jìn)行改造得到高性能菌株，但是在其耐鹽調(diào)節(jié)方面仍存在許多未知。而對(duì)藍(lán)晶鹽單胞菌的逆向改造如低鹽、高pH存活，可以進(jìn)一步降低鹽廢水處理成本、更高的細(xì)胞分離度和更高的PHA純化度。
而由于細(xì)胞體內(nèi)參與生物過程控制的細(xì)胞蛋白通常表現(xiàn)出不同的分配策略，以應(yīng)對(duì)外部壓力，如鹽度的滲透壓，熱休克、紫外線照射等，對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的理性設(shè)計(jì)以獲得鹽脅迫的調(diào)節(jié)就存在了一定的難度。常壓室溫等離子體技術(shù)（ARTP）是一種全基因組隨機(jī)突變方法，由于微生物耐鹽性的機(jī)制涉及系統(tǒng)級(jí)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，因此能夠?qū)崿F(xiàn)全基因組隨機(jī)突變的ARTP更適合于藍(lán)晶鹽單胞菌的底盤改造。
研究人員以野生單胞菌TD01及3個(gè)重組菌TDH4，TD68，TD68-194為出發(fā)菌株，分別驗(yàn)證其在高濃度（50g/L NaCl）和低濃度（10g/L NaCl）鹽環(huán)境下的生長狀況，結(jié)果顯示所有菌株在低鹽濃度的平板中均未出現(xiàn)菌落（圖2）。對(duì)這4株菌進(jìn)行ARTP誘變，誘變時(shí)間5分鐘，致死率曲線顯示最佳處理時(shí)間為3分鐘（圖2）。在誘變后的庫中篩選出4株在低鹽濃度情況下生長最迅速的菌，進(jìn)行第二輪誘變，最后得到4株菌： TD01A2B5, TDH4A1B5, TD68A2B3 and TD68-194A1B5（圖2）。 其中TDH4A1B5菌具有優(yōu)良生產(chǎn)性能，細(xì)胞干重可以達(dá)到11g/L，含有60%質(zhì)量百分比的PHA產(chǎn)量。
對(duì)突變菌株TDH4A1B5進(jìn)行基因水平的改造，加入phaCAB操縱子，增強(qiáng)代謝通量，在7L體系中進(jìn)行的40小時(shí)未滅菌補(bǔ)料分批發(fā)酵，相較于野生型的PHB和P34HB產(chǎn)量分別增加了21%和36%（圖3）。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行改造使得蘇氨酸分泌率和外泌素分泌率分別提高了50%和77%，多方面的解析顯示了其低鹽濃度底盤菌的應(yīng)用潛力（圖4）。通過基因比對(duì)，揭示了嗜鹽宿主菌株的鹽脅迫調(diào)控機(jī)制，包括101個(gè)與滲透壓相關(guān)的基因。更重要的是，通過使用重組嗜藍(lán)菌TDH4A1B5，在7L發(fā)酵體系下的PHA的成本降低了1/3，這顯著提高了其經(jīng)濟(jì)競(jìng)爭(zhēng)力（圖5）。
圖1 本文技術(shù)路線圖
圖2 ARTP誘變數(shù)據(jù)
圖3 對(duì)H. bluephagenesis TDH4A1B5的改造來高產(chǎn)PHA
圖4 對(duì)H. bluephagenesis TDH4A1B5的改造應(yīng)用于多種蛋白的生產(chǎn)
圖5 低鹽發(fā)酵與高鹽發(fā)酵的成本分析
論文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.ymben.2023.08.001
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