前言
補料工藝的優(yōu)化是發(fā)酵工藝優(yōu)化最重要的研究方向之一，持續(xù)而又穩(wěn)定的補料速率往往對最終產(chǎn)物的合成和菌株的代謝方向影響較大。多數(shù)產(chǎn)物的合成在補料過程中需要嚴格將培養(yǎng)基中的糖控制在一定濃度。傳統(tǒng)的控糖主要依靠操作人員不斷地取樣檢測與手動調(diào)節(jié)補料速度，時效性較差，調(diào)控效果也較差。發(fā)酵工程師們也始終在尋找著更穩(wěn)定，更精確的控糖方式。本案例以色氨酸生產(chǎn)菌株E. coli TM01為出發(fā)菌株，采用賽多利斯（7 L）平行生物反應器，分別通過手動控糖和生物培養(yǎng)過程在線檢測儀（BODS）的自動檢測控糖策略兩種不同方式維持培養(yǎng)基中葡萄糖濃度，以色氨酸產(chǎn)量為指標來對比不同控糖模式的差異。
圖1 天木生物生物培養(yǎng)過程在線檢測儀（BODS）
實驗過程
實驗菌種：E. coli WT01。
種子液培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，葡萄糖20 g/L；
發(fā)酵液培養(yǎng)基：葡萄糖25 g/L，酵母提取物7 g/L，一水合檸檬酸1.1 g/L，硫酸銨7.5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，三水合磷酸氫二鉀3 g/L，七水合硫酸鎂1 g/L，七水合硫酸鐵0.1 g/L，維生素B1 0.1g/L，甘油10 g/L，抗壞血酸 0.45 g/L，搖瓶發(fā)酵額外加入碳酸鈣5 g/L；
發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：取甘油管中菌種活化后轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)12 h后，按5%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵過程在賽多利斯7L發(fā)酵罐中進行，通氣量為1vvm，通過溶氧關聯(lián)攪拌轉(zhuǎn)速將溶氧控制在30%，通過流加氨水將pH維持在6.9。37℃培養(yǎng)至OD600到10左右后，降溫至30℃并加入IPTG誘導。發(fā)酵過程中當培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗完畢后，流加500 g/L的葡萄糖溶液將殘?zhí)菨舛瓤刂圃?2g/L。
手動補料組每1h取樣檢測培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛?，并根?jù)所測濃度手動調(diào)整補料策略。自動補料組使用天木生物的生物培養(yǎng)過程在線檢測儀（BODS）實時檢測培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛?，并由儀器自動調(diào)整補糖策略。發(fā)酵液中色氨酸濃度由液相進行檢測對比。
實驗結(jié)果
如圖2所示，在手動補料模式下，由于無法實時觀察菌體的生長情況，培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛炔▌虞^大，而且由于夜間操作人員疲勞，誤差最大時甚至達到了+10 g/L的差異。殘?zhí)菨舛鹊牟▌又苯佑绊懥司w的生物量和色氨酸產(chǎn)量，手動控糖組色氨酸產(chǎn)量最高時僅有約0.3 g/L。而與之相比，BODS的智能關聯(lián)補料摒棄了人為操作帶來的誤差，可以全天候?qū)崟r監(jiān)控發(fā)酵液中菌體的生長情況、檢測培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛龋ò咐性O置為1h自動取樣并檢測一次）并反饋給系統(tǒng)，然后根據(jù)設置值實時調(diào)整補料策略使糖穩(wěn)定的維持在設定值（2±0.2g/L），更好的控糖策略也帶來了色氨酸產(chǎn)量的大幅度增加，與手動補料模式相比，BODS智能關聯(lián)補料模式下色氨酸產(chǎn)量提高了約71.4%。
圖2 手動補料和智能關聯(lián)補料發(fā)酵結(jié)果對比
結(jié)論
本案例以產(chǎn)色氨酸工程菌株為出發(fā)菌株，研究了不同補料策略下對菌株色氨酸產(chǎn)量的影響。實驗結(jié)果證明：更穩(wěn)定的控糖方式往往會帶來產(chǎn)量大幅度的增加。與手動補料模式相對比，BODS智能關聯(lián)系統(tǒng)在無操作人員的情況下通過自動取樣檢測、監(jiān)控、反饋調(diào)節(jié)、自主學習補料策略等方式將培養(yǎng)基中殘?zhí)撬椒€(wěn)定的控制在了設定值（2±0.2g/L），也使菌株的色氨酸產(chǎn)量提高約71.4%，這說明了BODS在發(fā)酵工藝優(yōu)化中的重要作用。除此之外，在工業(yè)化生產(chǎn)中殘?zhí)菨舛鹊目刂埔彩侵苯佑绊懫髽I(yè)產(chǎn)品質(zhì)量的關鍵參數(shù)，BODS的實時檢測能力也有助于生產(chǎn)車間人員實時掌控發(fā)酵過程變化，及時調(diào)整工藝參數(shù)，幫助企業(yè)更好的完成產(chǎn)物的放大生產(chǎn)。
自成立伊始，天木生物恪守客戶至上的原則，致力于提供高度專業(yè)化的菌種優(yōu)化方案，為發(fā)酵過程優(yōu)化提供更多可靠選擇。
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