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illumina測(cè)序基本知識(shí)
閱讀：2947發(fā)布時(shí)間：2019-7-1
個(gè)要給大家講的，是它這個(gè)flowcell。Flowcell翻成中文，就叫“流動(dòng)池”。
我們來(lái)看這個(gè)圖片。圖片當(dāng)中，我們看到一個(gè)象載玻片大小的芯片。這個(gè)芯片里面，是做了8條通道。在這個(gè)通道的內(nèi)表面，是做了專(zhuān)門(mén)的化學(xué)修飾。它的化學(xué)修飾，主要是用2種DNA引物，把它（2種DNA引物）種在玻璃表面。
這兩種（DNA引物的）序列是和接下來(lái)要測(cè)序的DNA文庫(kù)的接頭序列相互補(bǔ)的。而且這2種引物是通過(guò)共價(jià)鍵，連到Flowcell上去。之所以要用共價(jià)鍵連到Flowcell上去，是因?yàn)榻酉聛?lái)有大量的液體要流過(guò)這個(gè)Flowcell，只有有共價(jià)鍵連接的這些DNA，才不會(huì)被沖掉。這就是Flowcell。
文庫(kù)制作
再接下來(lái)，講一下文庫(kù)、和文庫(kù)的制作（過(guò)程）所謂的DNA文庫(kù)，實(shí)際上是許多個(gè)DNA片段，在兩頭接上了特定的DNA接頭，型成的DNA混合物。
文庫(kù)有2個(gè)特點(diǎn)，第1個(gè)特點(diǎn)，是當(dāng)中這一段插入的DNA，它的序列是各種各樣的。第2個(gè)特點(diǎn)，它的兩頭的接頭序列，是已知的，而且是人工特地加上去的。要做這個(gè)文庫(kù)，首先是把基因組DNA，用超聲波打斷。然后打斷之后，兩頭用酶把它補(bǔ)平，再用Klenow酶在3'端加上一個(gè)A堿基。然后，再用連接酶把這個(gè)接頭給連上去。
連好了接頭的DNA混合物，我們就稱(chēng)為一個(gè)“文庫(kù)”。英文也稱(chēng)作“library”。
橋式PCR
做好了Library之后，就要做橋式PCR了。橋式PCR，實(shí)際上是把文庫(kù)種到芯片上去，然后進(jìn)行擴(kuò)增，這樣的一個(gè)過(guò)程。
這個(gè)過(guò)程，首先是把文庫(kù)加入到芯片上，因?yàn)槲膸?kù)兩頭的DNA序列，和芯片上引物是互補(bǔ)的，所以，就會(huì)產(chǎn)生互補(bǔ)雜交。
雜交完了之后，我們?cè)谶@里面加入dNP和聚合酶。聚合酶會(huì)從引物開(kāi)始，延著模板合成出一條全新的DNA鏈來(lái)。
新的這條鏈，和原來(lái)的序列是*互補(bǔ)的。
接下來(lái)，我們?cè)偌尤隢aOH堿溶液。DNA雙鏈在NaOH堿溶液存在下，就解鏈了。而且被液流一沖，原來(lái)的那個(gè)（模板）鏈，也就是沒(méi)有和芯片共價(jià)連接的鏈，就被沖走了。而和芯片共價(jià)連接的鏈，就被保留下來(lái)。
然后，我們?cè)僭谝毫鞒乩锛尤胫行砸后w，主要是為了中和這個(gè)堿液，在加入中和液之后，整個(gè)環(huán)境變成中性了。這時(shí)侯，DNA鏈上的另外一端，就會(huì)和玻璃板上的第二種引物，發(fā)生互補(bǔ)雜交。
接下來(lái)，我們加入酶和dNTP，聚合酶就延著第二個(gè)引物，合成出一條新鏈來(lái)；然后，我們?cè)偌訅A，把2條鏈解鏈解開(kāi)；然后，我們?cè)偌又泻鸵?，這時(shí)侯，DNA鏈會(huì)和新的引物雜交。再加酶，再加dNTP，又從新引物合成出新的鏈來(lái)。
連續(xù)重復(fù)這一過(guò)程，DNA鏈的數(shù)量，就會(huì)以指數(shù)方式增長(zhǎng)。
制備單鏈
在橋式PCR完成之后，接下來(lái)要做的工作，就是要把合成的雙鏈，變成可以測(cè)序的單鏈。
辦法是通過(guò)一個(gè)化學(xué)反應(yīng)，把其中一個(gè)引物上的一個(gè)特定的基團(tuán)給切斷掉。
然后，再用堿溶液來(lái)洗這個(gè)芯片。這時(shí)侯，堿讓DNA的雙鏈解鏈，那根被切斷了根的DNA鏈就被水沖掉了。留下那根共價(jià)鍵連在（芯片）上面的鏈。
接下來(lái)，再加入中性溶液，然后在這個(gè)中性溶液里面加入測(cè)序引物。
正式測(cè)序
好，接下來(lái)正式的測(cè)序工作就開(kāi)始了。
那么，在測(cè)序的時(shí)侯，加入進(jìn)去的，主要是2個(gè)東西：一個(gè)是帶熒光標(biāo)記的dNTP。而這個(gè)dNTP，它還有一個(gè)特點(diǎn)，它的3'末端是被一個(gè)疊氮基堵住的。
然后，再加一個(gè)聚合酶，聚合酶就會(huì)選擇：哪一個(gè)dNTP是和原來(lái)位置上的那個(gè)堿基是互補(bǔ)的，根據(jù)互補(bǔ)性原理，把這個(gè)dNTP合成到新的這個(gè)DNA鏈上去。
因?yàn)檫@個(gè)dNTP的3'端是被一個(gè)疊氮基團(tuán)堵住了，所以，它一個(gè)循環(huán)只能延長(zhǎng)一個(gè)堿基。然后，它就停在那兒了。
合成完了之后，就用水把多余的dNTP和酶給沖掉。
沖掉之后，就放到顯微鏡下，去進(jìn)行激光掃描。根據(jù)發(fā)出來(lái)的熒光來(lái)判斷它是哪個(gè)堿基。
因?yàn)?種dNTP，它每一種dNTP上面標(biāo)的熒光素都不一樣，根據(jù)紅、黃、藍(lán)、綠，它出來(lái)的哪種顏色，那么，就可以倒過(guò)來(lái)推出來(lái)，這個(gè)新合成上去的堿基，是哪種堿基。
因?yàn)樾潞铣傻膲A基，是和原來(lái)位置（的堿基）是互補(bǔ)的，所以，又推出模板上那個(gè)堿基是哪個(gè)。
這一個(gè)循環(huán)完成之后，就加入一些化學(xué)試劑，把疊氮基團(tuán)和旁邊標(biāo)記的熒光基團(tuán)切掉。切完了之后，3'端的羥基就暴露出來(lái)。
再接下來(lái)，加入新的dNTP和新的酶，然后，又延長(zhǎng)一個(gè)堿基。新延長(zhǎng)完一個(gè)堿基之后，把多余的酶和dNTP沖掉，再進(jìn)行一輪顯微的激光掃描，再讀一下這個(gè)堿基是什么。
不斷重復(fù)這個(gè)過(guò)程，可以重復(fù)上百次，到幾百次，就可以把上百個(gè)堿基，甚至更多堿基的序列讀出來(lái)。
讀Index
那么，什么是Index哪？是因?yàn)镮llumina的評(píng)委會(huì)個(gè)測(cè)序量很大，往往一個(gè)樣本，用不了那么幾億條DNA。所以，科學(xué)家就想了一個(gè)辦法。在文庫(kù)的接頭上做了一些標(biāo)記，每一個(gè)樣本，它有一個(gè)特定的接頭，每個(gè)接頭里面，它有一段特定的序列。
這段特定的序列，我們就稱(chēng)為Index。也有人把它叫做Barcode，反正，表達(dá)的是一個(gè)意思：這么一段特定的序列，標(biāo)記了樣本的來(lái)源。
那么，要讀這個(gè)Index的序列，先用堿把上面這根測(cè)完“Read1”的序列，把上面這根DNA鏈給解鏈掉。
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