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了解一下牛血清白蛋白的提取方法吧
閱讀：5255發(fā)布時(shí)間：2022-4-20
牛血清白蛋白BSA大概是生化實(shí)驗(yàn)室最為常見(jiàn)、應(yīng)用最為廣泛的蛋白質(zhì)了。雖然小小的BSA并不那么起眼，但是在生化實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，卻常常扮演十分關(guān)鍵的角色。
BSA前體蛋白全長(zhǎng)607個(gè)氨基酸。前體蛋白從N端脫去18個(gè)信號(hào)肽，以及6個(gè)前肽，形成含有583個(gè)氨基酸、分子量約為66.5kDa的成熟BSA蛋白。
牛血清白蛋白提取方法，包括以下步驟：
1.血液分離
取新鮮的牛血液6000毫升，加入667毫升38%的檸檬酸三鈉，使檸檬酸三鈉在牛血液中的終重量濃度為3.8%，然后通過(guò)血球分離機(jī)(GFX-105血液分離機(jī)、遼陽(yáng)翔隆制藥機(jī)械有限公司)，對(duì)牛血液進(jìn)行分離(轉(zhuǎn)速16300rpm/min)，分離得到血細(xì)胞和血漿。
2.蛋白沉淀溶解
2.1取步驟1中的血漿4000毫升，加入6000毫升的飽和硫酸銨，使硫酸銨在血漿中的終濃度為60%，并攪拌1h，使血漿中的蛋白質(zhì)沉淀，去除上清液，保留蛋白沉淀。
2.2按與蛋白沉淀的質(zhì)量比為5:1的比例加入超純水6000毫升，溶解上述蛋白沉淀，得到蛋白溶解液7000毫升。
3.第一次濃縮換液
通過(guò)超濾機(jī)對(duì)步驟2.2中得到蛋白溶解液進(jìn)行超濾濃縮，超濾機(jī)上所用超濾膜包的超濾膜的截留分子量為5KD，調(diào)節(jié)超濾機(jī)的參數(shù)(MiniPellicon超濾系統(tǒng)、merkmillipore公司)，流速為400ml/min、跨膜壓為0.1psi，濃縮10倍，同時(shí)，用20mM、pH7.0的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行換液。即用恒流泵將第一磷酸鹽緩沖液加入到正在濃縮過(guò)程中的蛋白溶解液中，并通過(guò)恒流泵控制第一磷酸鹽緩沖液的流速使蛋白溶解液的體積維持穩(wěn)定，得到蛋白濃縮液700毫升。
4.第一次純化
用層析純化儀(APPSMV100D、利穗(蘇州)科技有限公司)對(duì)上述蛋白濃縮液進(jìn)行層析純化，以二乙基氨基乙基-纖維素(二乙基氨基乙基離子交換介質(zhì))作為層析柱填料。上柱前，用20mM、pH7.0的磷酸鈉緩沖液平衡，流速10ml/min，平衡體積5CV;平衡結(jié)束后，將蛋白濃縮液上柱層析，控制流速8ml/min;上樣結(jié)束后，用平衡液平衡5CV，流速為10ml/min;用含1mol/L氯化鈉的20mM、pH7.0的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫(從0%B到100%B拉梯度洗脫，共10CV)，收集得到粗白蛋白溶液400ml毫升。洗脫后，用2mol/L的氯化鈉溶液對(duì)層析柱進(jìn)行再生處理。
5.第二次進(jìn)行換液
通過(guò)超濾機(jī)對(duì)步驟4中得到粗白蛋白溶液進(jìn)行超濾濃縮，超濾機(jī)上所用超濾膜包的超濾膜的截留分子量為5KD，調(diào)節(jié)超濾系統(tǒng)的參數(shù)，流速為400ml/min、跨膜壓為0.1psi，用20mM、pH5.0的檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行換液。得到粗蛋白液600毫升。
6.第二次純化
用層析純化儀對(duì)上述粗蛋白濃縮液層析純化，以磺丙基-纖維素(磺丙基離子交換介質(zhì))作為層析柱填料。上柱前，用20mM、pH5.0的檸檬酸鈉緩沖液平衡，流速6ml/min，平衡體積10CV;平衡結(jié)束后，將蛋白濃縮液上柱層析，流速4ml/min，直接收集流出液，得到高純度的低雜質(zhì)含量的牛血清白蛋白溶液1000ml毫升。經(jīng)冷凍干燥后記得到牛血清白蛋白粉。
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