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SABC雙標(biāo)試劑盒說明書

 試劑盒組成:

1，  封閉液：10ml，5%BSA

2，  生物素化二抗：濃縮液100ul。

3，  SABC-FITC:濃縮液100ul。

4，  SABC-POD:濃縮液100ul。

5，  稀釋液：30ml。

6，  顯色液:20×DAB顯色液A,20×DAB顯色液B

7，  抗熒光衰減封片劑

試劑盒簡介：

本試劑盒適合于一抗為小鼠/兔IgG/山羊的免疫組化實(shí)驗. DAB及FITC顯色。

SABC是專為免疫組化和其他免疫檢測而設(shè)計的，用以顯示組織和細(xì)胞中抗原分布。鏈霉親和素(StreptAvidin)是一種從鏈霉菌中提取的蛋白質(zhì)，同親和素一樣，對生物素有*的親和力，親和素是一個堿性蛋白質(zhì)（IP=10），經(jīng)改造后可以轉(zhuǎn)變成中性蛋白質(zhì)。鏈霉親和素等電點(diǎn)接近中性，對組織和細(xì)胞的非特異吸附很低，基于鏈霉親和素的免疫組化方法背景很低。SABC即StreptAvidin—Biotin Complex。SABC大約可形成一百個左右的過氧化物酶和五十個左右的鏈霉親和素所構(gòu)成的復(fù)合物。大量的酶將保證SABC具有很高的敏感性。

自備試劑：

1．粘片劑多聚賴氨酸。

2． 0.01 M PBS（pH7.2-7.4）

3． 0.01M檸檬酸鈉緩沖液

4、抗熒光衰減封片劑

 實(shí)驗步驟:

以石蠟切片熱修復(fù)為例

1. 切片常規(guī)脫蠟至水。3%H2O2室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶（如果FITC，剛可省掉此步）。蒸餾水洗3次。

2．熱修復(fù)抗原:將切片浸入0.01M 枸櫞酸鹽緩沖液（PH6.0）,電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5-10分鐘后，反復(fù)1-2次。冷卻后PBS（pH7.2-7.6）洗滌1-2次。

3．滴加5%BSA封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體, 不洗。

4．用稀釋液將一抗（如兔抗IL-10）按一定比例稀釋（稀釋后的一抗4℃可保存一周），也可另行購買抗體稀釋液。滴加稀釋的一抗，37 ℃ 1小時左右或20℃時2小時左右。也可4℃過ye。PBS（pH7.2-7.4）洗2分鐘×3次。（一抗的稀釋度、孵育時間和溫度與染色強(qiáng)度、背景有直接關(guān)系。一般來說，陽性染色強(qiáng)度不夠時，可提高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時間；背景過高時，可降低一抗?jié)舛群涂s短孵育時間。）

5．根據(jù)使用量,用稀釋液將生物素化二抗?jié)饪s液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul生物素化羊抗兔IgG濃縮液,混勻即成工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加生物素化羊抗兔IgG工作液,20-37℃ 30分鐘。PBS（pH7.2-7.4）洗2分鐘×3次。

如果想用熒光觀察，請接下面步驟，如果想用DAB顯色，請?zhí)^6-7。

6．根據(jù)使用量,用稀釋液將SABC-FITC濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul SABC-FITC濃縮液，混勻即成SABC-FITC工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加SABC-FITC工作液,20-37℃，30分鐘(避光)。PBS（pH7.2-7.4）洗5分鐘×4次。

7．滴加抗熒光衰減封片劑封片。熒光顯微鏡觀察。

如果想用DAB顯色，請接8。

8．根據(jù)使用量,用稀釋液將SABC-POD濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul SABC-POD濃縮液，混勻即成SABC-POD工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加SABC-POD工作液,20-37℃，30分鐘。PBS（pH7.2-7.4）洗5分鐘×4次。

9．DAB顯色:根據(jù)用量，用PBS（pH7.2-7.4）配制，按1mlPBS加入50ul 20×DAB顯色液A，加入50ul 20×DAB顯色液B ?；靹蚝蠹又燎衅?。室溫顯色, 鏡下控制反應(yīng)時間，一般在5-30分鐘之間。蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。

10．蘇木素輕度復(fù)染。脫水,透明,封片。顯微鏡觀察。

對于細(xì)胞片，常規(guī)固定后，PBS漂洗兩次，再用0.5%Txiton X-100室溫20分鐘，PBS漂洗兩次，3%H2O2（如果FITC，剛可省掉此步）處理15分鐘；PBS漂洗兩次，下接上面第4步。

對于冰凍切片，固定后，可用PBS漂洗兩次，再接上面第二步。

注意事項：如果染色背景過高，在SABC反應(yīng)之后，DAB顯色之前,用加有0.01—0.02% TWEEN-20的PBST（pH7.2-7.4）洗滌切片4次，PBS洗2次，然后DAB顯色。

因為免疫組化指標(biāo)眾多，標(biāo)本不一，此步驟僅作參考。

注意事項：如果染色背景過高，在SABC反應(yīng)之后，用加有0.01—0.02% TWEEN-20的PBST（pH7.2-7.4）洗滌切片4次，PBS洗2次，然后封片觀察。