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產(chǎn)品描述

Annexin V-647/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒提供了一種快速簡便的方法，通過標(biāo)記早期凋亡細(xì)胞（遠(yuǎn)紅）和壞死細(xì)胞（紅色），用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。產(chǎn)品可以使用流式細(xì)胞儀或其它熒光檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

Annexin V-647可以標(biāo)記凋亡細(xì)胞。Annexin V選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱 PS)。在細(xì)胞發(fā)生早期凋亡時(shí)，PS 會(huì)外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。用遠(yuǎn)紅色熒光探針647 標(biāo)記的 Annexin V，即 Annexin V-647，可以結(jié)合外翻的磷酯酰絲氨酸，從而檢測(cè)細(xì)胞凋亡的重要特征。我們公司的647染料與普通熒光素相比，熒光亮度更高，且不受環(huán)境中 pH 的影響，具有良好的光穩(wěn)定性。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種 DNA 結(jié)合染料，它可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞的細(xì)胞核。PI 可以由 488,532 或 546 nm 的激光激發(fā)，呈現(xiàn)紅色熒光。

訂購信息

保存方法

冰袋運(yùn)輸，4℃避光保存，保質(zhì)期12個(gè)月。

使用方法

   下列實(shí)驗(yàn)方案以利用星形孢菌素誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡為例，如果使用其他誘導(dǎo)劑和其他類型的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)條件需要略作調(diào)整。

1.流式細(xì)胞檢測(cè)

（1）根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。檢測(cè)樣品中應(yīng)包含未經(jīng)處理的細(xì)胞樣品，作為陰性對(duì)照。此外，設(shè)定一組樣品做單染，用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。

（2）收集細(xì)胞。懸浮細(xì)胞：300 g，4℃離心5 min收集細(xì)胞；貼壁細(xì)胞：用不含EDTA的胰酶消化后300 g，4℃離心5 min收集細(xì)胞，胰酶消化時(shí)間不宜過長，以防引起假陽性。

注：用胰蛋白酶消化然后使細(xì)胞在合適的細(xì)胞培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中恢復(fù)約30分鐘，然后再染色。胰蛋白酶消化會(huì)暫時(shí)破壞質(zhì)膜，允許Annexin V結(jié)合磷脂酰絲氨酸在細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)表面上，從而導(dǎo)致假陽性染色。

（3）用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次均在300 g，4℃下離心5 min，收集1-5×105個(gè)細(xì)胞并用100μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。

（4）每管加入 4-5μL的Annexin V-647和5μL的PI工作液。

注：我們推薦準(zhǔn)備兩管額外的流式管，每管中只加入一種單染染料（Annexin V-647和PI各一管），用于流式的補(bǔ)償調(diào)節(jié)。

（5）室溫避光孵育 10-15 min，為避免影響細(xì)胞凋亡進(jìn)程，孵育過程可在冰上操作。

（6）每管加入400μL的PBS或1×結(jié)合緩沖液，盡快通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。Annexin V-647可以由647 nm激光激發(fā)，檢測(cè)熒光發(fā)射光譜約在647 nm處（APC通道），PI發(fā)射光譜約在617 nm處。

2.熒光顯微鏡檢測(cè)

   對(duì)于懸浮細(xì)胞，可參照流式細(xì)胞檢測(cè)的方法進(jìn)行具體操作。

（1）在蓋玻片或載玻片小室中接種細(xì)胞。

（2）根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。檢測(cè)樣品中應(yīng)包含未經(jīng)處理的細(xì)胞樣品，作為陰性對(duì)照。

（3）用PBS 洗滌細(xì)胞。

注：細(xì)胞收集后如果不用PBS清洗，可以用含血清的培養(yǎng)基直接替代Annexin V結(jié)合緩沖液，但是 Annexin V的使用濃度需要重新優(yōu)化。

（4）每 100 μL的Annexin V結(jié)合緩沖液中加入5-25μL的Annexin V-647和 5μL的PI。

注：適宜使用濃度由具體實(shí)驗(yàn)要求確定。

（5）向培養(yǎng)板中加入足量的染液以覆蓋全部細(xì)胞，室溫避光孵育15-30 min。為避免影響細(xì)胞凋亡進(jìn)程，孵育過程可在冰上操作，但孵育時(shí)間至少延長至30 min。

（6）用 1×結(jié)合緩沖液清洗細(xì)胞。

（7）將孵育有細(xì)胞的蓋玻片置于載玻片上，載玻片可提前加一滴 1×結(jié)合緩沖液；對(duì)于培養(yǎng)在小室內(nèi)的細(xì)胞，可直接加入足量的 1×結(jié)合緩沖液覆蓋細(xì)胞。

（8）使用合適的濾光片在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。Annexin V-647可用 APC 適用的濾光片，PI可用 Cy3或者Texas濾光片。

注意事項(xiàng)

熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。