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His鎳柱標(biāo)簽蛋白純化，就是這么簡(jiǎn)單
簡(jiǎn) 介
1975年，Porath等人提出了一種新的純化方法-固定化金屬鰲合層析，利用金屬離子（Ni2+，Cu2+等）與氨基酸表面的殘基（如組氨酸的咪唑基）的配位鰲合作用，來(lái)純化與金屬離子有親和作用的蛋白質(zhì)。
組氨酸標(biāo)簽由于分子量小，幾乎不干擾靶蛋白的功能、活性和結(jié)構(gòu)而被廣泛的使用。固定的金屬離子親和層析是純化組氨酸標(biāo)簽蛋白的常用方法。
組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化工具
月旭Ni親和填料Ni Tanrose 6FF（NTA）
Ni Tanrose 6FF（NTA）親和介質(zhì)是將金屬離子Ni2+鰲合在以氨三乙酸為配基的6%高度交聯(lián)的瓊脂糖凝膠上形成的親和層析介質(zhì)。月旭科技研發(fā)的Ni Tanrose 6FF（NTA）不僅純化純度較高，通過(guò)控制合理的Ni離子密度，結(jié)合載量可達(dá)到～40mgHis標(biāo)簽蛋白/ml介質(zhì)，可以用于各種表達(dá)來(lái)源（如大腸桿菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞）的組氨酸標(biāo)簽（6xHis-tagged）蛋白的純化。NTA含有四個(gè)螯合區(qū)，較一般的三齒螯合劑能更好的結(jié)合Ni2+。6xHis可與Ni2+螯合，從而使His標(biāo)簽蛋白結(jié)合在Ni Tanrose 6FF（NTA）純化介質(zhì)上，未結(jié)合的蛋白被洗滌下去，結(jié)合在介質(zhì)上的蛋白經(jīng)過(guò)一定濃度的咪唑或低pH緩沖液被溫和的洗脫下來(lái)，從而得到高純度的目標(biāo)蛋白。具有載量高、選擇性好、易于再生、成本低等優(yōu)點(diǎn)。有了它，再也不用擔(dān)心完不成純化任務(wù)了。
PreCot Ni 6FF（NTA）是Ni Tanrose 6FF（NTA）的1ml和5ml預(yù)裝柱，用來(lái)純化6xHis-tagged蛋白，可以使用注射器、蠕動(dòng)泵，或者液相層析系統(tǒng)（例如AKTA或FPLC）。
Ni Tanrose 6FF（NTA）應(yīng)用案例
預(yù)裝柱：PreCot Ni 6FF（NTA） 5ml
樣品：含有His標(biāo)簽蛋白（大腸桿菌表達(dá)）
平衡液A：50mM Tris-HCl，0.5M NaCl,20mM咪唑pH8.0
洗脫液B：50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，0.5M 咪唑，pH8.0
流速：平衡、洗脫-1.0ml/min上樣-0.5ml/min
PreCot Ni 6FF（NTA）純化His標(biāo)簽蛋白的純化色譜圖
1：原液
2：流穿
3：洗脫（100%B）
4：原液
5：流穿
6：洗脫（100%B）
備注：1-3（樣品和平衡液中不含咪唑）；4-6（樣品和平衡液中含20mM咪唑）
由于宿主蛋白中也存在組氨酸和/或半胱氨酸氨基酸殘基，其他的非特異性蛋白與靶蛋白一起與金屬離子親和層析填料結(jié)合，造成純化樣品純度不高。提高樣品中的咪唑濃度，組氨酸標(biāo)簽蛋白通過(guò)Ni Tanrose 6FF（NTA），可以一步純化得到85%以上純度的純化樣品。
