什么是傳代細胞培養(yǎng)？

原代細胞或細胞株或細胞系需在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的原代細胞或細胞株或細胞系或得到大量的同種細胞，并維持細胞種的延續(xù)，這個過程體外培養(yǎng)稱為傳代細胞培養(yǎng)。一般認為，細胞培養(yǎng)形成單層匯合，細胞密度與生存空間有密切的關(guān)系，將培養(yǎng)細胞分散，以1:2或l:3或1:4以上的比率轉(zhuǎn)移分散進行培養(yǎng)，即為傳代細胞培養(yǎng)。細胞傳代后，一般經(jīng)過三個階段：游離期、指數(shù)增生期和停止期。

常用細胞分裂指數(shù)表示細胞增殖的旺盛程度，即細胞群的分裂相數(shù)／100個細胞。一般細胞分裂指數(shù)介于0.2％～0.5％，腫瘤細胞可達3～5％。細胞接種2～3天分裂增殖旺盛，是活力時期，稱指數(shù)增生期(對數(shù)生長期)，適宜進行各種試驗。

一、傳代細胞的傳代培養(yǎng)

（1）吸除或倒掉原瓶中的舊培養(yǎng)基（以25mL培養(yǎng)瓶為例）。

（2）每瓶加入2mL,無鈣、鎂PBS，漂洗一次后倒掉。

（3）每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液），輕輕搖動培養(yǎng)瓶，經(jīng)消化液鋪滿所有細胞表面，待細胞層略有松動，肉眼可觀察到“薄膜”現(xiàn)象時，倒掉消化液，再繼續(xù)作用2~3分鐘，輕輕搖動，細胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細胞回縮變圓，細胞間隙增大，此時應立即終止消化。

（4）加入*培養(yǎng)基5mL，用吸管反復吹打瓶壁上的細胞，吹打時要按順序進行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時動作要輕柔，不要用力過大，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，以避免細胞的機械損傷。

（5）用計數(shù)板計數(shù)，計算細胞的濃度，并用培養(yǎng)基調(diào)整適當?shù)募毎麧舛群笤俜制颗囵B(yǎng)。

二、傳代細胞的建系和維持

1、細胞檔案

細胞檔案要記錄好，如組織來源、生物學特性（由形態(tài)、生長繁殖曲線、染色體核型情況、代謝特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有無支原體和潛存病毒等）、培養(yǎng)基的要求、傳代換液時間、擴增時間（分裂指數(shù)），細胞的特殊遺傳標志（標記染色體）等，這些記錄對于保證細胞的正常生長，保持細胞的一致和經(jīng)長期培養(yǎng)細胞特性的變異比較，都有十分重要的意義。

2、換液傳代

（1）細胞系的傳代、換液方法與前相同，但一般都有自身的規(guī)律性，因而在繼續(xù)傳代時，要注意保持其穩(wěn)定的規(guī)律性，這樣可以減少由于傳代時細胞密度的頻繁增減或換液時間的不規(guī)律而導致細胞生長特性的改變，給以后的實驗帶來影響。

（2）多種細胞系維持傳代，要嚴格操作程序，對所用的試劑各系不能交叉。每傳5代后，細胞種子均應凍存。傳代時均應作好記錄，培養(yǎng)瓶上要有明顯標記，標記細胞系名稱和傳代的代數(shù)及傳代時間。細胞種子的及時凍存不僅可防止污染丟失，而且還可防止因盲目傳代而造成細胞變異，此外還可提供不同代次的細胞同時進行對比試驗。