細胞凍存簡介

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細胞置于 -196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復(fù)蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。

為什么要進行細胞凍存

連續(xù)培養(yǎng)的細胞系容易發(fā)生遺傳漂變，有限細胞系終會發(fā)生衰老，所有培養(yǎng)的細胞都易受到微生物污染，即使運轉(zhuǎn)情況d好的實驗室也會遇到設(shè)備故障的問題。由于已建立的細胞系是一種寶貴資源，更換細胞系成本高昂，而且耗費時間，因此，十分有必要將細胞冷凍起來長期保存。除此之外，還可以利用細胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細胞。

培養(yǎng)細胞凍存方案

以下實驗方案介紹了培養(yǎng)細胞凍存的一般流程。詳細的實驗方案，必須參閱針對具體細胞的產(chǎn)品說明書。

實驗前準(zhǔn)備

用具紫外照射消毒（30min）：無菌培養(yǎng)瓶，15ml 離心管，移液管，移液槍，槍頭。采用通風(fēng)機通風(fēng) 3min。以 75% 酒精擦拭操作臺和雙手，準(zhǔn)備好冰盒，離心機調(diào)節(jié)至 800rpm，5min。
配制細胞凍存液：凍存液應(yīng)該提前配置，于 2℃至 8℃下儲存，直至使用。凍存液常規(guī)通常配比為基礎(chǔ)培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1。加大凍存液中血清量有利于某些脆弱的肝細胞或珍貴的細胞的保存，可調(diào)整為血清：DMSO=9:1。

胰蛋白酶 /EDTA 消化

從培養(yǎng)箱中取出待傳代的細胞（將蓋子擰緊），75% 酒精進行瓶口消毒，吸掉培養(yǎng)細胞的舊培養(yǎng)基，PBS 緩沖液洗去殘留的舊培養(yǎng)基，加入消化液，放入顯微鏡下觀察，待所有細胞變圓后立即拿入超凈臺內(nèi)，加入細胞*培養(yǎng)基中止消化，消化時間為 1-5min，具體以細胞而異，采用無菌吸管輕輕吹打細胞表面，注意吹打全部培養(yǎng)表面，取所有的細胞懸液放入干凈的 15ml 離心管內(nèi)，每分鐘 1000rpm，5min。

細胞凍存

取出凍存管，注明細胞名稱，代數(shù)，日期。離心后，以無菌吸管吸棄上清，不要吸到底部的細胞沉淀。將細胞沉淀與凍存液充分混勻，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，將細胞總數(shù)調(diào)節(jié)成細胞數(shù)量為 5-10*10⁵/ml 為宜。將細胞凍存懸液分裝進細胞凍存管中，一般 2ml 的凍存管中裝入 1-1.5ml 凍存液為宜。嚴(yán)密封口后，使用可控制降溫速度的冷凍裝置冷凍細胞，使溫度每分鐘大約降低 1℃?；蛘?，將裝有細胞的凍存管放入異丙的醇凍存盒中，然后將凍存盒置于 –80℃條件下過夜。若無凍存盒及其他凍存裝置，可以先將凍存管置于 4℃ 30min，再 -20℃凍存 1h 直至*冷凍，再轉(zhuǎn)移至 -80℃冰箱過夜。第二天將已經(jīng)冷凍的細胞轉(zhuǎn)移到液氮容器中，置于液氮上方的氣相空間中儲存。

注意事項

凍存細胞系以備將來之用時，必須遵守以下原則。我們建議您嚴(yán)格遵守您所用細胞系附帶的操作說明，以便獲得d佳結(jié)果。
• 在細胞處于生長期密度達到 70-90% 的情況下進行培養(yǎng)細胞的凍存，并且細胞傳代盡可能靠前。確保凍存前活細胞百分比至少為 90%。請注意d佳凍存條件取決于所用細胞系。
• 細胞應(yīng)緩慢冷凍，可使用可控制降溫速度的低溫冰箱或者低溫冷凍容器，使溫度每分鐘大約降低 1°C。
• 必須使用推薦的凍存培養(yǎng)基。凍存培養(yǎng)基中應(yīng)含有 DMSO 或者甘油等冷凍保護劑。冷凍保護劑可降低培養(yǎng)基的冰點，并可減緩冷卻速度，大大降低冰晶形成的危險 (冰晶可損傷細胞，導(dǎo)致細胞死亡)。注：DMSO 可促進有機分子進入組織。操作含 DMSO 的試劑時，應(yīng)采用與此類物質(zhì)安全危害相適應(yīng)的設(shè)備和操作規(guī)范，并應(yīng)按照當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)處置此類試劑。建議可使用廠商生產(chǎn)的無血清細胞凍存液，使用方便，復(fù)蘇率高。
• 注意冷凍保護劑 DMSO 的品質(zhì)：DMSO 應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色，以 5-10ml 小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。
• 將冷凍的細胞于–70℃以下溫度儲存；溫度高于–50℃時，冷凍的細胞將開始變質(zhì)。
• 必須使用無菌凍存管儲存冷凍的細胞。裝有冷凍細胞的凍存管可浸于液氮或者在液氮上方的氣相空間內(nèi)保存。生物危害性物質(zhì)必須儲存在液氮上方的氣相空間內(nèi)。將密封的凍存管置于氣相空間儲存可避免凍存管發(fā)生爆炸。如果使用液氮進行儲存，必須注意玻璃和塑料凍存管有發(fā)生爆炸的危險，應(yīng)佩戴面罩或護目鏡。
• 所有與細胞接觸的溶液和設(shè)備均應(yīng)為無菌狀態(tài)。必須采用正確的無菌技術(shù)，并且在層流通風(fēng)櫥內(nèi)進行。
• 實行細胞慢凍的原則：緩慢凍存，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。而復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。

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