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毛細管色譜柱的選擇
閱讀：3491 發(fā)布時間：2017-2-21毛細管色譜柱是目前氣相色譜中用到zui多的色譜柱，可以說是氣相色譜分離的核心，今天就和大家說說這一根毛細管色譜柱從選用、安裝到保養(yǎng)維護乃至更換的那些事兒。看看一根毛細管色譜柱的一生都經(jīng)歷了什么，我們?nèi)绾巫瞿苎娱L它的壽命呢？
分析時，選擇*的毛細管柱可能是一件非常困難的任務(wù)。雖然沒有色譜柱選擇的簡易技巧、捷徑、竅門或秘訣，但卻有些指南和概念來簡化此過程。
一根色譜柱的規(guī)格描述包括其固定相的種類和內(nèi)外部尺寸（柱內(nèi)徑、長度和膜厚等）。不同規(guī)格的色譜柱，對樣品的分離結(jié)果影響也不盡相同，如樣品分離的洗脫順序、保留時間、分離度和峰形/峰高等。另外，在實際分析應(yīng)用中，色譜柱的性能指標，如惰性、塔板數(shù)和柱流失率等，同樣會嚴重影響到樣品的分離效果。
毛細管柱的種類
一般將毛細管柱分為四種類型：壁涂開管柱（WCOT）、載體涂漬開管柱（SCOT）、交聯(lián)毛細管柱(CLOT）和多孔層開管柱（PLOT）。經(jīng)典的毛細管柱為壁涂開管柱(WCOT——WallCoated Open Tubular Column)，管內(nèi)經(jīng)預(yù)處理后將固定液直接涂漬在內(nèi)壁上。因其制備難、柱子的重復(fù)性差、內(nèi)表面小、涂漬量小和相比β值大，將導(dǎo)致有效塔板數(shù)和實際分離能力不高，且熱穩(wěn)定性也較差，已很少使用。
多孔層壁涂柱（PLOT——PorousLayer Open Tubular Column）：內(nèi)壁上僅涂一層多孔性吸附劑微粒，是毛細管氣固色譜柱。
載體壁涂柱（SCOT——SupportCoated Open Tubular Column）：內(nèi)壁上先涂一層載體，載體上再涂固定液。固定液膜可以較厚，柱容量也較大。必須注意，以上兩種柱子中的載體只是涂布于毛細管柱的壁上，而非充滿整根柱子。
交聯(lián)毛細管柱(CLOT——Cross-LinkedOpen Tubular Column)：涂好固定液后再用偶聯(lián)劑交聯(lián)鍵合，柱子性能有很大改善，能耐高溫，抗水、抗溶劑。
其中PLOT柱主要用于*氣體和低分子量有機化合物的分離；SCOT柱所用固定液的量大一些，故柱容量大一些，但由于制備技術(shù)復(fù)雜，應(yīng)用也不太普遍。毛細管GC中的主力軍是CLOT，其柱材料大多用熔融石英，即所謂彈性石英柱。
毛細管氣相色譜柱的選擇
a. 固定相的選擇原則和方法
理論上講，選擇固定相遵循相似性原則，即：用非極性固定相分析非極性物質(zhì)，用極性固定相分析極性物質(zhì)，用含芳香基團的固定相分析芳香族化合物。在填充柱時代，這個想法是非常正確的，因為那個時候，分離度是首先需要把握的關(guān)鍵因素，分不開，就沒辦法想其它。它的理由在于塔板理論的推論，即：組分在固定相中有越大的溶解度差異，就會產(chǎn)生越大的分離度。
但是在毛細管色譜時代，分離度不再始終是分析的問題。毛細管具有幾十萬塊塔板，如此大的柱效率，以至于不再需要充分考慮分離問題了。這個時候，樣品兼容性、使用溫度、穩(wěn)定性、柱流失情況等，都可能成為選擇的主要理由。
例如分析甲醇乙醇丙醇等低級醇類，正常應(yīng)選擇wax類高極性色譜柱。但是在雜質(zhì)較少的情況下，選擇DB-1這樣的非極性柱具有更高的靈活性和使用壽命。具體選擇
要依據(jù)以下規(guī)則：
1.因為非極性毛細管柱具有明顯的穩(wěn)定性、高使用溫度、良好的色譜峰形等有利因素，因此易分離物質(zhì)應(yīng)首先選用極性小的色譜柱。
2.分析氫鍵型物質(zhì)用氫鍵型PEG柱更佳。
3.輕烴或*氣體用PLOT柱更佳。
4.高苯基固定相對芳香族物質(zhì)保留能力更強。但是分析二甲苯等芳烴異構(gòu)體，Wax類強極性色譜柱。
在過去的幾十年中，所有的GC應(yīng)用中，非極性色譜柱的使用率高于中等極性柱和極性柱。一般來說，非極性柱，如HP-5MS柱，可應(yīng)用與于50%以上的分析。而極性或中等極性柱，如PEG柱，大概適用于25%的分析應(yīng)用中。通常，我們會先選擇非極性色譜柱，而極性色譜柱會選擇性的用于比較簡單的樣品（較少種類化合物組成的樣品）。
在選擇適用的固定相時，分析設(shè)備和分析條件也是需要參考的指標。如檢測器的種類、載氣和進樣體積等。
如果我們不考慮對樣品選擇性和檢測靈敏度的影響，那么就使用檢測器低響應(yīng)固定相的色譜柱。比如說含氰基的固定相，像1301、1701、624等這樣的色譜柱就盡量不要與NPD（氮磷檢測器）連用。對于超低流失的固定相，如-1MS或-5MS的柱子，因為它們可以保證zui低的檢測基線和噪聲水平，所以在做低或超低檢測限樣品時，超低流失色譜柱是的選擇。如果我們使用的載氣不純，或是設(shè)備中有氣體泄漏，這樣的問題無法解決或無法及時解決，為了不使柱固定相過早的被破壞，高溫適用固定相的色譜柱是相對好的選擇。
另外，除非方法需要，我們盡量選擇鍵合固定相的色譜柱，對比非鍵合相和非交聯(lián)相色譜柱，交聯(lián)鍵合固定相色譜柱對樣品種類和進樣體積的耐受力更強，柱性能下降的zui慢。
在做應(yīng)用方法確證時，我們可同時使用非極性柱和極性柱，對色譜峰鑒定或分離結(jié)果進行確證。通常我們做農(nóng)藥分析方法確證時，選用-5MS和 -1701/-35色譜柱；做殘留溶劑分析方法確證時，選用-5MS和-624/-VMS色譜柱；做醇類或FAME分析方法確證時，選用PEG和含氰基固定相色譜柱；做汽油中氧化物分析方法確證時，選用-1和PEG色譜柱。
b. 色譜柱內(nèi)徑的選擇
標準色譜柱內(nèi)徑（ID）尺寸為0.2mm、0.25mm、0.32mm和0.53mm。少數(shù)方法會使用到0.1mm和0.8mm內(nèi)徑的柱子。0.25mm是zui常用的色譜柱內(nèi)徑尺寸，而0.53mm的色譜柱通常是替代填充柱用于大體積進樣的方法應(yīng)用。
色譜柱內(nèi)徑的大小對分離效果的影響是明顯的。越細的色譜柱，其塔板數(shù)就越高，柱效就越高，但同時樣品承載容量越小，進樣體積就需要減少。但內(nèi)徑越小，通常意味著柱容量的減小，在分析低含量組分時，對檢測器靈敏度和進樣口分流能力的要求越高。因此在選擇內(nèi)徑的時候，首先考慮的是樣品分析難點，是在于分離還是檢測。對于分離困難的樣品，較小口徑的色譜柱；對于含量過低檢測困難的樣品，較大口徑的色譜柱。在容易分離的情況下，一般選擇小口徑毛細管柱可以縮短柱長，減小分析時間。
c. 色譜柱長度
色譜柱的長短直接影響到保留時間和分離效率。實驗室應(yīng)用的色譜柱長多為5m、7.5m、10m、12.5m、15m、25m、30m、50m、60m、75m、100m和105m等。zui常見的色譜柱長度是30m。
對于快速分析來說，除了選擇適當?shù)膬?nèi)徑，柱長度也短許多（例如5～15mx 0.25mm）。只有這樣，才有可能在zui短的時間內(nèi)，得到*的分離效果和分析結(jié)果。
如果方法需要改進提高分辨率，較長的色譜柱，如60m或100m，是理想的選擇。分辨率與柱長的平方根成正比。需要注意的是，像一根60m長的色譜柱相對于30m的柱子，其分辨率提高近40%，但分析時間會成倍增長。
在揮發(fā)物的分析應(yīng)用中，為了改善分離效果，常使用較長的柱型，如50m、60m和100m等。在氣態(tài)樣品和精細烴分析應(yīng)用中，較長色譜柱的使用較為普遍。
更長的色譜柱會影響柱惰性、柱流失和柱效等多個方面。同時，需要更高的載氣壓力或更換載氣的種類（如把氮氣更換成氫氣/氦氣）。
d. 色譜柱膜厚
商品化色譜柱的膜厚規(guī)格一般是0.1μm、 0.15μm、 0.25μm、 0.5μm、 1.0μm、 1.5μm、 3μm、5μm等等。實驗室中zui常見的色譜柱膜厚為0.25μm、0.5μm和1μm。
膜厚主要影響兩個指標：保留時間和樣品負載能力。
另外，色譜柱適用溫度范圍、分析時間和分析結(jié)果的準確性和可靠性等也與膜厚有關(guān)。例如一根內(nèi)徑為0.25mm，膜厚為0.1μm的色譜柱可以達成快速分離的效果，甚至可以改進分辨率，降低色譜柱的流失，適用于更寬泛的溫度范圍等。膜厚會影響到色譜柱惰性，而這個指標在有些應(yīng)用中是非常重要的。同時膜厚對色譜柱樣品承載能力的影響也是很明顯的。
0.25μm× 0.25mm、0.5μm × 0.32mm、1μm或1.5μm × 0.53mm規(guī)格的色譜柱在分離效果、保留性能、分辨率、惰性和柱流失等指標方面較為均衡，使用也較多。
膜厚與柱內(nèi)徑的關(guān)系體現(xiàn)在相比（β）上。相比β是色譜柱中氣相容積和固定相容積之比，計算公式為β=r/2d，其中r為色譜柱半徑，d為液膜厚度。相比是決定一個固定長度色譜柱中組分流出時間的決定性因素。如果有兩根相同相比和固定相的色譜柱，內(nèi)徑不同，在相同的溫度條件下，兩根色譜柱的分離效果和保留性能相同或相似。
需要注意的是：相比只是決定保留時間的主要因素，但并不是決定理論塔板數(shù)（柱效率）的主要因素。決定柱容量（zui小檢出量）的主要因素是內(nèi)徑和膜厚，決定柱效率的是內(nèi)徑，決定保留時間的是相比。在綜合平衡柱容量、柱效率、分析時間三方面因素的時候，需要注意相比的影響。
zui后要強調(diào)的一點是，選擇色譜柱是必須要看具體的分析任務(wù)。如果是做法規(guī)分析，則必須按有關(guān)法規(guī)的要求選擇色譜柱。如一些產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗，盡管用毛細管柱可以得到更好的分析結(jié)果，且分離效率高、分析速度快，但若國家標準或行業(yè)標準規(guī)定用填充柱，那就應(yīng)該用填充柱，否則分析結(jié)果不被法規(guī)所認可。當然，作為方法開發(fā)的研究，用毛細管柱常常是有利的。
新色譜柱的驗收
新買的氣相色譜柱到貨后要進行驗收，驗收首先是對貨物的外包裝進行觀察，如有破損，應(yīng)直接拒絕接受，要求供應(yīng)商重新發(fā)貨。打開包裝后，色譜柱如沒有可見的斷裂、破損，可在安裝、老化后使用標準物質(zhì)進行柱效測試。
新柱子都有說明書，說明書一般都附有質(zhì)量檢測報告，附譜圖、條件、試樣等，如果實驗室備有相應(yīng)的測試標準物質(zhì)，可照其條件試驗一下，計算塔板數(shù)、分離度等，與其報告相差不大即可。亦可依據(jù)自己的分析用途，用本實驗室的實際條件進行樣品分析，與實驗室以前的正常柱子比較，保留時間、分離度、塔板數(shù)等是否正常即可判斷。建議保留新柱子的測試圖譜，以備以后柱效下降時對比參考。
色譜柱的安裝
把毛細管柱安裝在色譜儀上時，需要將其兩端分別與進樣口和檢測器相連接。一般儀器所用的接頭有兩種，分別是內(nèi)螺紋接頭和外螺紋接頭。原理都是用一個石墨密封墊，通過接頭壓緊而達到固定和密封的目的。
正確的安裝請參考以下步驟：
a. 檢查氣體過濾器、載氣、進樣墊和襯管等，保證輔助氣和檢測器的用氣暢通有效。如果以前做過較臟樣品或活性較高的化合物，需要將進樣口的襯管清洗或更換。
b. 先將密封墊套在柱頭，此時應(yīng)將柱頭向下，避免密封墊碎屑進入柱管而造成堵塞。將石墨墊套在柱頭后，應(yīng)將柱頭截去1～2cm。可用專門的柱切割器，也可用一個開安剖瓶的磁片，在柱頭上輕輕地劃一下，然后用手掰斷。這樣做可以保證柱端是整潔的，又避免了柱頭污染物對分析的干擾，因為截去了穿過密封墊時可能進入柱頭的污染物，或者運輸過程中可能損壞的柱端。
將色譜柱連接于進樣口上，色譜柱在進樣口中插入深度根據(jù)所使用的GC儀器不同而定。正確合適的插入能zui大地保證試驗結(jié)果的重現(xiàn)性。通常來說，色譜柱的入口應(yīng)保持在進樣口的中下部，當進樣針穿過隔墊*插入進樣口后,如果針尖與色譜柱入口相差1～2cm，這就是較為理想的狀態(tài)。檢測器一端則是柱出口盡量接近檢測點（如FID的火焰），以避免死體積造成的柱外效應(yīng)（具體的插入程度和方法參見所使用GC的使用手冊）。避免用力彎曲擠壓毛細管柱，并小心,不要讓標記牌等有鋒利邊緣的物品與毛細柱接觸摩擦，以防柱身斷裂受損。
c.用手把連接螺母擰上，擰緊后（用手擰不動了）用扳手再多擰1/4-1/2圈，保證安裝的密封程度。因為不緊密的安裝，不僅會引起載氣的泄漏，而且有可能對色譜柱造成*損壞。為保證柱端伸出的長度準確，可在截去柱端后，先量好柱頭伸出長度，然后用記號筆或改字液在接頭下方的色譜柱上做記號，擰緊接頭以后保證該記號正好位于柱頭端面。這樣就避免了擰緊過程中柱管移動可能造成的伸出長度不準確。
d. 接通載氣
當色譜柱與進樣口接好后，可參考表3.4，由柱長、柱內(nèi)徑等參數(shù)選取初始的柱前壓，然后通載氣，調(diào)節(jié)柱前壓以得到合適的載氣流速。
將色譜柱的出口端插入裝有正己烷的樣品瓶中，正常情況下，我們可以看見瓶中穩(wěn)定持續(xù)的氣泡。如果沒有氣泡，就要重新檢查一下載氣裝置和流量控制器等是否正確設(shè)置，并檢查一下整個氣路有無泄漏。等所有問題解決后，將色譜柱出口從瓶中取出，保證柱端口無溶劑殘留，再進行下一步的安裝。
e. 將色譜柱連接于檢測器上,其安裝和注意的事項與色譜柱與進樣口連接大致相同。如果在應(yīng)用中系統(tǒng)所使用的是ECD或NPD等，那么在老化色譜柱時，應(yīng)該將柱子與檢測器斷開，這樣檢測器可能會更快達到穩(wěn)定。
f. 確定載氣流量，再對色譜柱的安裝進行檢查。注意：如果不通入載氣就對色譜柱進行加熱，會快速且*性的損壞色譜柱。
色譜柱的老化與老化效果檢測
色譜柱安裝和系統(tǒng)檢漏工作完成后，就可以對色譜柱進行老化了。
a． 老化的方法：
老化的方法通常是將色譜柱升至一恒定溫度，通常為其溫度上限。特殊情況下，可加熱至zui高使用溫度之上約10～20℃左右，但是一定不能超過色譜柱的溫度上限，那樣極易損壞色譜柱。
當?shù)竭_老化溫度后，記錄并觀察基線。初始階段基線應(yīng)持續(xù)上升，在到達老化溫度后5～10分鐘開始下降，并且會持續(xù)30～90分鐘。當?shù)竭_一個固定的值后就會穩(wěn)定下來。如果在2～3小時后基線仍無法穩(wěn)定或在15～20分鐘后仍無明顯的下降趨勢，那么有可能系統(tǒng)有泄漏或者污染。遇到這樣的情況，應(yīng)立即將柱溫降到40℃以下，盡快的檢查系統(tǒng)并解決相關(guān)的問題。如果還是繼續(xù)的老化，不僅對色譜柱有損壞而且始終得不到正常穩(wěn)定的基線。
另外，老化的時間也不宜過長，不然會降低色譜柱的使用壽命。一般來說，涂有極性固定相和較厚涂層的色譜柱老化時間長，而弱極性固定相和較薄涂層的色譜柱所需時間較短。
b. 設(shè)置確認載氣流速
對于毛細管色譜柱，載氣的種類高純度氮氣或氫氣。載氣的純度大于99.995%，而其中的含氧量越少越好。如果您使用的是毛細管色譜柱，那么依照載氣的平均線速度（cm/sec），而不是利用載氣流量（mL/min）來對載氣做出評價。因為柱效的計算采用的是載氣的平均線速度。推薦平均線速度值：氮氣：10～12cm/sec；氫氣：20～25cm/sec。
在載氣的管線中加入氣體過濾裝置不僅可以延長色譜柱壽命，而且很大程度的降低了背景噪音。建議安裝一個高容量脫氧管和一個載氣凈化器。使用ECD系統(tǒng)時，能在其輔助氣路中也安裝一個脫氧管。
c.柱流失檢測
在色譜柱老化過程結(jié)束后，利用程序升溫作一次空白試驗（不進樣）。一般是以10℃/min從50℃升至zui高使用溫度，達到zui高使用溫度后保持10min。這樣我們就會得到一張流失圖。這些數(shù)值可能對今后作對比試驗和實驗問題的解決有幫助。
在空白試驗的色譜圖中，不應(yīng)該有色譜峰出現(xiàn)。如果出現(xiàn)了色譜峰，通?？赡苁菑倪M樣口帶來的污染物。如果在正常的使用狀態(tài)下，色譜柱的性能開始下降，基線的信號值會增高。另外，如果在很低的溫度下，基線信號值明顯的大于初始值，那么有可能是色譜柱和GC系統(tǒng)有污染。
色譜柱的保存
色譜柱用進樣墊將色譜柱的兩端封住，并放回原包裝。在安裝時要將色譜柱的兩端截去一部分，以確保沒有進樣墊的碎屑殘留于柱中。
色譜柱的重新安裝
色譜柱重新安裝時,密封要注意：
a.安裝位置(尺寸)要重現(xiàn)，否則引起峰靈敏度變化；
b.安裝時防止碎渣進入色譜柱引起峰形拖尾；
c.不需要擰得太緊；
e.使用清潔的密封墊，避免用手接觸密封墊，以防手上的油脂污染；
f.密封墊安裝前，要仔細檢查有無損傷，以防安裝后，有問題時不易拆除；
g.對那些不宜重復(fù)使用，如石墨密封墊，重新安裝柱時要注意及時更換。
什么時候該更換色譜柱
分離度是考察一根色譜柱分離具體樣品的好壞程度的指標。色譜的核心任務(wù)就是為了使每個峰完成分離，得到有合理峰寬的色譜峰，以便獲得較低的檢測限。然而，塔板數(shù)對分離度的影響僅僅是平方根的關(guān)系，當一根色譜柱的塔板數(shù)下降50%，分離度僅下降7%。
其實，大多數(shù)用戶僅僅使用色譜柱塔板數(shù)的一小部分。例如，對一支新的150mm×4.6mm，5mm粒徑的色譜柱來講，廠家測試報告上的塔板數(shù)為14，000。使用下面的公式可以估算一支色譜柱的塔板數(shù)：N=3000L/Dp
L是色譜柱的柱長，以厘米為單位；Dp是填料的粒徑，以微米為單位。
一支150mm×4.6mm，5mm粒徑的色譜柱的柱效大約為9000，比廠家測試數(shù)據(jù)低30%。在實際的工作中，大多數(shù)色譜方法僅僅需要這些塔板數(shù)的一半，可見，色譜柱的塔板數(shù)不是分離中zui重要的參數(shù)。
較好的方法是使用壓力、分離度和峰形的混合指標來考察一根色譜柱的狀態(tài)。
壓力的測量是zui容易的，通常我們確定的色譜方法要滿足以下的要求：用新柱子時柱壓不高于2500psi，在任何情況下壓力都不超過3000psi。有統(tǒng)計表明，超過60%的色譜柱損壞是由于壓力過高的原因。
分離度是考察色譜柱的一個非常重要的指標，只要兩個組分可以獲得基線分離，對該分析物的定量就不會有什么問題。對于高斯峰來講，1.5的分離度即可得到基線分離；若分離度在1.7至2.0之間則更好。若峰拖尾嚴重則需要更高的分離度。使用分離度作為色譜柱的評價指標的好處在于我們可以直觀地看到相鄰的峰的分離情況。
另外一個考察色譜柱質(zhì)量的標準是峰形拖尾情況，廠家測試報告的峰形都非常漂亮，但這并不代表該色譜柱分析實際樣品的情況。
通常，在開發(fā)分析方法的過程中，一般會試驗幾根色譜柱，分析足夠多的實際樣品，就知道當分離變差時是什么樣的情況。在開始時可使用一個寬的范圍；如果在開始時緊縮系統(tǒng)適用性要求，在方法認證后再放寬這個要求，是很困難的。在分析實際樣品之前進行系統(tǒng)適用性考察，以確保該色譜方法滿足分析者可以接受的標準。