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技術(shù)文章

如何應(yīng)對液相色譜的小情緒?

閱讀:2406          發(fā)布時間:2017-5-22

方便快捷的分析過程固然重要,但是為了多做樣品而忽略了一些*的步驟,往往得不償失。哪些操作不能做?哪些懶兒不能偷?那些小概率的故障師傅沒教怎么辦?液相使用過程中有哪四大關(guān)鍵因素要注意?

流動相不過濾
因為塵?;蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥,因此應(yīng)預(yù)先除去流動相中的任何固體微粒。流動相在玻璃容器內(nèi)蒸餾,而常用的方法是濾過,可采用Millipore濾膜(0.2μm或0.45μm)等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒(或片)。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。
使用后沒有及時清洗泵
流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì),含有緩沖液的流動相不應(yīng)保留在泵內(nèi),尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內(nèi),由于蒸發(fā)或泄漏,甚至只是由于溶液的靜置,就可能析出鹽的微細晶體,這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此,必須泵入純水將泵充分清洗后,再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑(對于反相鍵合硅膠固定相,可以是甲醇或甲醇-水)。
流動相走空
泵工作時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完,否則空泵運轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán),zui終產(chǎn)生漏液。
沒有流動相流出,又無壓力指示怎么辦?
可能是泵內(nèi)有大量氣體,這時可打開泄壓閥,使泵在較大流量(如5ml/min)下運轉(zhuǎn),將氣泡排盡,也可用一個50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環(huán)磨損,需更換。
壓力和流量不穩(wěn)了?
原因可能是氣泡,需要排除;或者是單向閥內(nèi)有異物,可卸下單向閥,浸入丙酮內(nèi)超聲清洗。有時可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡,或被鹽的微細晶粒或滋生的微生物部分堵塞,這時,可卸下砂濾棒浸入流動相內(nèi)超聲除氣泡,或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸(如4mol/L硝酸)內(nèi)迅速除去微生物,或?qū)Ⅺ}溶解,再立即清洗。
壓力為啥過高或過低?
可能是是管路被堵塞,需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應(yīng)逐段進行。
在進行梯度洗脫時,由于多種溶劑混合,而且組成不斷變化,因此帶來一些特殊問題,必須充分重視:
梯度洗脫的流動相選擇不當(dāng)
要注意溶劑的互溶性,不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶,超出范圍后就不互溶,使用時更要引起注意。當(dāng)有機溶劑和緩沖液混合時,還可能析出鹽的晶體,尤其使用磷酸鹽時需特別小心。
忽略的空白梯度洗脫
梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高,以保證良好的重現(xiàn)性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫,以辨認溶劑雜質(zhì)峰,因為弱溶劑中的雜質(zhì)富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需*脫氣,以防止混合時產(chǎn)生氣泡。
忽略了溶劑混合所帶來的粘度變化
混合溶劑的粘度常隨組成而變化,因而在梯度洗脫時常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小,當(dāng)二者以相近比例混合時粘度增大很多,此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的zui大壓力。
關(guān)于六通閥的正確使用和維護:
①樣品溶液進樣前必須用0.45μm濾膜過濾,以減少微粒對進樣閥的磨損。
②轉(zhuǎn)動閥芯時不能太慢,更不能停留在中間位置,否則流動相受阻,使泵內(nèi)壓力劇增,甚至超過泵的zui大壓力;再轉(zhuǎn)到進樣位時,過高的壓力將使柱頭損壞。
③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中,每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進樣閥。通??捎盟疀_洗,或先用能溶解樣品的溶劑沖洗,再用水沖洗。
關(guān)于色譜柱的使用和維護  
色譜柱的正確使用和維護十分重要,稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中,需要注意下列問題,以維護色譜柱。
調(diào)節(jié)流速太快
避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料,因此在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進行,在閥進樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩(如前所述)。
反沖色譜柱
一般說來色譜柱不能反沖,只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時,才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。
預(yù)柱和保護柱
選擇使用適宜的流動相(尤其是pH),以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預(yù)柱,分析柱是鍵合硅膠時,預(yù)柱為硅膠,可使流動相在進入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”,避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi),需要對樣品進行預(yù)處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以
而且應(yīng)該經(jīng)常更換。

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