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神經(jīng)干細胞的微環(huán)境（上）

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按：細胞微環(huán)境對于細胞的生長發(fā)育和動態(tài)平衡非常重要。不同細胞類型其微環(huán)境也不同。本文根據(jù)國外Stem Book相關章節(jié)編譯，內(nèi)容是神經(jīng)干細胞微環(huán)境。但其他類型細胞微環(huán)境模式與之相近，因此，該文所描述的神經(jīng)干細胞微環(huán)境可看作是細胞微環(huán)境的一個范式。

在哺乳動物中，神經(jīng)干細胞在發(fā)育早期出現(xiàn)，并且在生物體的整個壽命期內(nèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)保持活性。在發(fā)育過程中，它們呈現(xiàn)不同的細胞形態(tài)并且駐留在不斷變化的微環(huán)境中，同時保留干細胞的基本性質(zhì)：多潛能和自我更新能力。本章將介紹神經(jīng)干細胞的基本形態(tài)特征，以及其微環(huán)境的基本結(jié)構成分和信號分子。在早期的神經(jīng)發(fā)育過程中，當神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育模式建立時，神經(jīng)干細胞被稱為神經(jīng)上皮細胞;它們位于其他神經(jīng)上皮細胞中間，并且暴露于各種信號中，例如視黃酸，刺猬蛋白和成纖維細胞生長因子。當神經(jīng)發(fā)生開始時，由于各種類型的神經(jīng)元祖細胞、分化細胞和細胞外信號分子的出現(xiàn)，干細胞被轉(zhuǎn)化為徑向膠質(zhì)細胞，并且其微環(huán)境的復雜性增加。zui后，在成年期間，神經(jīng)干細胞呈現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞形態(tài)，并且存在于被稱為神經(jīng)源性小室（neurogenic niches）的特定的微環(huán)境中。就在這些神經(jīng)源性小島上，其神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞在與胚胎發(fā)育過程中相似機制的控制下不斷產(chǎn)生。

1、胚胎神經(jīng)干細胞微環(huán)境

中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的發(fā)育是一個復雜的過程，依賴于在時間和空間上調(diào)節(jié)的一系列機制。在嚙齒動物中，存在于成年大腦中的大多數(shù)細胞在胚胎發(fā)生期間在大約一周的時間內(nèi)產(chǎn)生并遷移到它們各自的目的地。胚胎CNS是一種動態(tài)結(jié)構，它的尺寸不斷增加，而負責構建大腦的干細胞/前體細胞群體駐留在兩個明顯且相對較小的增殖區(qū)域中。*個是心室區(qū)（VZ），其中具有神經(jīng)干細胞（NSC）性質(zhì)的上皮細胞大約在胚胎期第8天出現(xiàn)，所有正在發(fā)育和成熟CNS細胞，包括成年NSCs，都來自于它（Alvarez-Buylla等，2001）。經(jīng)過一段時間的NSC /前體細胞擴增，隨著神經(jīng)發(fā)生的開始，第二個祖細胞群體開始從VZ中不對稱分裂的細胞中產(chǎn)生并且向底部遷移。它們稱為中間祖細胞或基礎祖細胞（intermediate progenitors or basal progenitors）。這些細胞對稱分裂以產(chǎn)生神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。它們遍及CNS和端腦。端腦中含有這些細胞的區(qū)域稱為室下區(qū)（SVZ; Martinez-Cerdeno等，2006; Smart，1972,1973）。

1.1 VZ的微環(huán)境

從細胞形態(tài)學上看，早期NSC微環(huán)境似乎是均一的（Pinto和Gotz，2007）。它由特征性雙極細胞組成（NEP），一端為頂端，連接VZ區(qū)，一端連接到軟腦膜，為基底區(qū)。NEP細胞內(nèi)的細胞核發(fā)生周期性基底-頂部易位，其有絲分裂總是發(fā)生在心室區(qū)，而S期發(fā)生在zui基底區(qū)域（Gotz和Huttner，2005; Pinto和Gotz，2007）。神經(jīng)上皮的厚度隨時間增加，以適應NEP細胞的數(shù)量增加。偶爾產(chǎn)生的神經(jīng)元，迅速遷移到神經(jīng)組織的軟腦膜（pial surface）。在大多數(shù)情況下，在嚙齒動物中，NEP細胞開始表達神經(jīng)膠質(zhì)細胞標志物，并呈現(xiàn)更細長的形態(tài)。為了反映這種轉(zhuǎn)變，新出現(xiàn)的神經(jīng)干細胞/祖細胞類型現(xiàn)在被稱為徑向膠質(zhì)細胞（RG），并保留了NEP細胞的雙相形態(tài)和細胞核動力學遷移特征。隨著神經(jīng)組織的增厚，大量神經(jīng)元產(chǎn)生，RG的基底端延長以保持與軟腦膜的附著（Rakic，2003）。因此，RG似乎是*能夠感測和整合來自至少四種不同微環(huán)境信息的胚胎CNS細胞：1）VZ區(qū)，主要由RG細胞胞體和頂端突起組成，以及新生成的遷移走的神經(jīng)元; 2）SVZ區(qū)，由基礎祖細胞和新生成的神經(jīng)元/神經(jīng)膠質(zhì)組成; 3）幔層（Mantle），由有絲分裂后的細胞組成;4）軟腦膜的基底層，它是一層RG基底軸突連接的富含細胞外基質(zhì)的膜。盡管目前尚不清楚這些微環(huán)境中細胞外信號通路是否存在，但zui近的一項研究顯示負責啟動神經(jīng)膠質(zhì)發(fā)生的神經(jīng)元分泌細胞因子（心肌營養(yǎng)因子1; Barnabe-Heider等人，2005）的存在。

   由于不同神經(jīng)細胞類型的產(chǎn)生和血管密集網(wǎng)絡的出現(xiàn)，幔層微環(huán)境的復雜性隨著發(fā)展的進展而增加（Herken等，1989）。還觀察到VZ復雜度的一起增加（Pinto和Gotz，2007），盡管這不是結(jié)構上顯而易見的，因為VZ主要是雙相神經(jīng)元的，“相同”的RG只有幾個插入的小的祖細胞（Gal等人，2006; Hartfuss等，2003）。然而，不同標志物的免疫染色和細胞命運研究的結(jié)果，表明具有不同功能和譜系的RG亞型的存在（Hartfuss et al，2003; Hartfuss et al，2001; Malatesta et al，2000; Plachta et al，2004; Williams和Price，1995），并且已經(jīng)確定，RG根據(jù)它們不同的位置特征（背側(cè)腹，尾狀尾，Guillemot，2005），攜帶有不同的內(nèi)在信息。zui后，應該指出，存在于VZ / SVZ內(nèi)部或外部有分泌生長因子或形態(tài)發(fā)生因子的特定區(qū)域的存在。（Assimacopoulos等，2003; Shimogori et al，2004）

1.2. 胚胎 NSC微環(huán)境的信號轉(zhuǎn)導

1.2.1 內(nèi)部調(diào)控

NSC /前體細胞的行為由外在和內(nèi)在機制控制?？寺∩L的胚胎第10天的皮質(zhì)祖細胞產(chǎn)生*個神經(jīng)元，然后產(chǎn)生神經(jīng)膠質(zhì)，類似于體內(nèi)神經(jīng)元發(fā)生在膠質(zhì)發(fā)生之前（Qian等人，1998; Qian等，2000）。后續(xù)研究顯示，該內(nèi)在定時器延伸到“正確”哦順序生成不同皮質(zhì)神經(jīng)元亞型（Shen等，2006）。此外，移植實驗已經(jīng)顯示，祖細胞在異位移植時保持其內(nèi)在的潛力（Darsalia等，2007; Olsson等，1998）。已經(jīng)顯示許多轉(zhuǎn)錄因子在NSC /祖細胞增殖和/或分化中起作用。這些包括編碼基本螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子（Bertrand等人，2002），SRY相關HMG盒（SOX）家族轉(zhuǎn)錄因子（Episkopou，2005），核受體雌激素受體（ Brannvall等，2002），過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Wada等，2006）和核受體共抑制子N-CoR（Hermanson等，2002）。許多上述因素的功能損失或功能已被證明足以改變祖細胞的表型、細胞周期和命運，而它們與細胞的環(huán)境無關（Bertrand等，2002; Campbell，2003; Guillemot，2005）。涉及細胞內(nèi)在性狀控制的另一種機制是表觀遺傳修飾。表觀遺傳調(diào)控涉及組蛋白和DNA修飾，它們能改變?nèi)旧|(zhì)的凝聚狀態(tài)，從而改變了基因的活性。組蛋白修飾包括甲基化，乙酰化和磷酸化。神經(jīng)元基因啟動子的組蛋白乙?；唤M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）和脫乙酰酶（HDAC）調(diào)節(jié)，并且組蛋白乙?；瘜τ谖捶只窠?jīng)祖細胞中這些基因的抑制是必需的（Ballas和Mandel，2005）。此外，與分化的神經(jīng)元相比，增殖型NSCs具有不同的組蛋白甲基化模式（Biron等，2004）。zui后，MiRNA也可以作為神經(jīng)元祖細胞行為的內(nèi)在調(diào)節(jié)因子（Cao等，2006），這是一個在不久的將來可以快速進展的領域。

1.2.2 彌散信號

微環(huán)境（外在因素）可通過彌散信號和/或介導細胞與細胞、細胞與ECM相互作用的分子，來調(diào)節(jié)神經(jīng)元前體細胞的行為。這些彌散信號在組織內(nèi)可形成梯度，并且可以在遠離信號源的區(qū)域傳遞信號。因此，在發(fā)育的CNS內(nèi)的每個位置，神經(jīng)干細胞/祖細胞會遇到信號的*組合，以指示細胞區(qū)域特異性的行為。

在調(diào)節(jié)細胞增殖和分化中具有關鍵作用的主要分子群是生長因子。幾種骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP），作為轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）家族的成員，沿著發(fā)育中腦的背部中線表達，是中線發(fā)育所必需的（Bertrand和Dahmane，2006; Campbell，2003）。 BMP2和4的過度表達導致細胞增殖減少和早熟神經(jīng)元的分化（Li等，1998）。添加抑制劑可逆轉(zhuǎn)這種作用（Li和LoTurco，2000）。截短的BMP I型受體的體內(nèi)過表達提供了BMPs促進增殖細胞分化的作用的另外的證據(jù)（Li等，1998）。

此外，幾種成纖維細胞生長因子（FGFs），特別是FGF8和FGF3在前腦神經(jīng)脊、中腦后腦屏障等表達（Mason，2007）。 FGF表達譜在發(fā)育過程中的復雜性增加，并且小鼠，小雞和斑馬魚都有所不同。 FGF活性不僅對于神經(jīng)系統(tǒng)的區(qū)域分化，而且對于其他功能也是至關重要的，例如前腦細胞（Storm等人，2003）和中腦后腦區(qū)域細胞（Chi et al，2003）需要FGF8才能存活。此外，F(xiàn)GF-2（或bFGF）是體外廣泛使用的促分裂原，能將胚胎端腦和神經(jīng)管的前體細胞保持在祖細胞狀態(tài)（Kalyani等，1997; Kilpatrick等，1993; Murphy等人，1990; Vescovi等人，1993）。bFGF缺陷小鼠由于NSC /前體細胞數(shù)量減少而使腦容積變?。╒accarino等人，1999）。 FGF家族在胚胎干/前體細胞行為中扮演的角色也受到所有FGF受體（FGFR）在體內(nèi)表達的支持（Bansal et al，2003）。 FGFR4被證明在大鼠神經(jīng)管神經(jīng)上皮細胞中高度表達（Kalyani等，1999），而大鼠背側(cè)端腦神經(jīng)上皮細胞被發(fā)現(xiàn)主要表達FGFR1和3，這些受體是對稱細胞分裂自我更新的關鍵（Maric et al，2007）。

除了生長因子外，另一組涉及神經(jīng)前體細胞行為調(diào)節(jié)的彌散分子是形態(tài)發(fā)生素和刺猬蛋白（Shh）。Shh信號傳導通過其受體patched1（PTC1）介導（Dessaud等人，2007），其在不存在Shh時，持續(xù)抑制Smo。在與Shh結(jié)合后，PTC1解除其對Smo的抑制，從而激活下游信號通路，導致出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活因子Gli1-3和Gli阻遏物的調(diào)節(jié)。Gli 2和3都在小鼠的VZ中強烈表達，而Shh和Gli 1弱表達（Dahmane等，2001; Hui等，1994）。 Shh參與整個發(fā)育中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腹側(cè)分型（Bertrand和Dahmane，2006; Campbell，2003），以及調(diào)節(jié)祖細胞增殖，因為Shh缺陷小鼠的特征是腦尺寸減小和獨眼畸形（cyclopia ）（Chiang等，1996; Muenke和Cohen，2000）?；趯li 2缺陷的小鼠的觀察，這種表型可能是由于VZ和SVZ中的細胞異常增殖（Palma和Ruiz i Altaba，2004）。已知在CNS發(fā)育過程中重要的第二種形態(tài)發(fā)生素是視黃酸（RA）。它是由視黃醛脫氫酶（RALDH1-3）在細胞內(nèi)產(chǎn)生的彌散分子。 RA通過CRABP1-2被留在細胞質(zhì)中，并且在結(jié)合RA受體（RAR1-3）和視黃酸X受體（RXR1-3; Maden，2002）之后在核中起作用。RA在非常早期的神經(jīng)元微環(huán)境中是重要的，其參與前后軸的調(diào)節(jié)（Maden，2002）。在后期階段，RA信號對于脊髓的背腹分型（Pierani等人，1999）和后腦分型是重要的（Marshall等人，1992）。zui近的研究表明，RA在腹側(cè)前腦中存在較高的水平（Takahashi和Liu，2006），調(diào)節(jié)皮層和紋狀體之間的中間區(qū)域的分化。

zui后，Wnt信號通路也被證明可以調(diào)節(jié)發(fā)育中大腦的細胞行為。在小鼠胚胎的VZ區(qū)域高水平表達Wnt受體Frizzled 5,8,9和分泌型frizzled蛋白1（Kim等人，2001; Van Raay等，2001），而功能研究已經(jīng)揭示W(wǎng)nt信號在背部前腦分化中的關鍵作用（Gunhaga等，2003; Hirabayashi等，2004; Machon等，2007）以及對VZ中NSC /前體細胞周期的調(diào)節(jié)。當β-連環(huán)蛋白信號傳導增強時，在VZ中觀察到退出細胞周期的細胞數(shù)量減少和腦區(qū)擴大（Chenn和Walsh，2002）。此外，皮質(zhì)祖細胞中β-連環(huán)蛋白的缺失導致增殖更弱和遷移缺陷（Backman等人，2005; Machon等，2003），并且靶向抑制β-連環(huán)蛋白導致VZ細胞過早地離開細胞周期，并分化成神經(jīng)元（Woodhead et al，2006）。zui近的一篇文章表明，β-連環(huán)蛋白信號傳導是維持VZ前體細胞群體所必需的。當VZ前體細胞轉(zhuǎn)變?yōu)橹虚g祖細胞（SVZ）時，β-連環(huán)蛋白信號下調(diào)；持續(xù)的β-連環(huán)蛋白活性導致VZ祖細胞庫擴增，并抑制中間祖細胞的產(chǎn)生（Wrobel等，2007）。

1.2.3. 細胞之間的相互作用

VZ和SVZ均以高密度的細胞體和軸突為特征，因此細胞與細胞的相互作用可能是調(diào)節(jié)祖細胞行為的另一途徑。已報道在VZ中存在 Ephrins B1和A5以及Eph A4和A7受體的表達（Depaepe et al。，2005; Greferath等，2002; Mackarehtschian等，1999; Stuckmann等，2001）。特別地，Ephrin B1被認為能促進細胞遷移出VZ，因為它的表達形成一個頂端到基底的濃度梯度（Stuckmann等，2001）。 Ephrin A5 / Eph A7可以通過促進NSC /前體細胞的凋亡來控制VZ祖細胞池的大?。―epaepe et al。，2005）。Notch途徑也已知在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮關鍵作用，如一系列小鼠突變研究所證明的（Hitoshi et al，2002; Yoon and Gaiano，2005）。 已有研究顯示Notch-1（Gaiano等，2000），Notch-3（Dang等，2006）和Delta-1（Beckers等人 ，2000）。在小鼠VZ區(qū)表達（Kostyszyn等，2004），人類VZ區(qū)存在Notch-1和Delta-1的強表達和Notch-3的弱表達。此外，腦室內(nèi)注射Notch配體能增加新產(chǎn)生的前體細胞的數(shù)量（Androutsellis-Theotokis等，2006）。Notch信號在細胞命運決定中也起關鍵作用，因為Notch-1或Notch-3的激活導致RG細胞數(shù)量增加（Dang et al，2006; Gaiano et al，2000）。與這些數(shù)據(jù)相一致，已報道在delta-like-1 缺陷小鼠中VZ區(qū)的面積減少和分化過早（Yun等，2002）。zui后，zui近的一項研究表明，對于 Notch的反應（通過CBF-1），VZ / SVZ區(qū)的的干/前體細胞和NSC（而不是中間祖細胞）（Mizutani等，2007）之間是不同的。

VZ中細胞與細胞相互作用的另一種形式可能是由鈣粘蛋白依賴性粘附連接（AJs）介導的，但鈣粘蛋白信號傳導在SVZ中的證據(jù)很少（Lathia et al。，2007b）。與室區(qū)相鄰的細胞層的特征是存在強的鈣粘蛋白表達（Aaku-Saraste等，1996），并且近來的工作已經(jīng)提出NSC /前體細胞后代的行為依賴于AJ（Kosodo等，2004）。幾乎沒有功能學上的證據(jù)直接將鈣粘蛋白信號與小鼠和雞的NSC /前體細胞行為相關聯(lián)，因為干擾鈣粘蛋白信號會導致神經(jīng)管的廣泛破壞（Kadowaki等，2007; Radice等，1997）。然而，有實驗證據(jù)表明N-鈣粘蛋白的抑制導致神經(jīng)干/前體細胞的過度增殖（Lele et al，2002; Noles和Chenn，2007）。縫隙連接是另外一種細胞間的通訊系統(tǒng)，這在調(diào)節(jié)干/前體細胞行為中可能是重要的。連接蛋白（Cx）26和43在VZ（Bittman和LoTurco，1999）中表達，Cx43與bFGF在體外維持干細胞/前體細胞處于未分化狀態(tài)的能力有關（Cheng等，2004）。有趣的是，即使在bFGF的存在下，Cx43的抑制也導致過早分化和細胞死亡（Cheng等，2004）。間隙連接也涉及前體細胞遷移，因為缺乏Cx43的小鼠由于不能遷移到皮質(zhì)板中而在中間區(qū)域中表現(xiàn)出前體細胞的累積（Fushiki等，2003）。zui近的一項后續(xù)研究進一步詮釋了這種影響，顯示Cx26和43在遷移的前體細胞對神經(jīng)膠質(zhì)纖維的粘附維持方面發(fā)揮作用（Elias等，2007）。

1.2.4 細胞和ECM的相互作用

ECM是VZ / SVZ微環(huán)境的另一個組成部分，可能對NSC /前體細胞行為的調(diào)節(jié)至關重要。神經(jīng)前體細胞的胞體和短的突起位于沒有傳統(tǒng)基底膜的區(qū)域，但仍然富含基質(zhì)分子，如各種層粘連蛋白（Campos等人，2004; Hunter等人，1992; Lathia等等，2007a）、層粘連蛋白受體——β1整合素（Campos等人，2004; Graus-Porta等人，2001; Hall等人，2006; Nagato等人，2005），糖蛋白肌腱蛋白-C（ Garcion等，2004）和硫酸軟骨素蛋白聚糖（CSPGs; von Holst 等，2006）。此外，VZ的許多雙極（神經(jīng)上皮或徑向膠質(zhì)細胞）細胞延伸了與基底軸突，使得能與軟膜區(qū)富含ECM的基底膜接觸?；纵S突微環(huán)境中的改變在人類與遷移缺陷引起的皮層畸形相關（Bonneau等人，2002; Toda等人，1994; Yoshida等人，2001）。小腦ECM組分缺失的小鼠，如層粘連蛋白γ1，整合素α6或β1（α6β1異源二聚體是CNS中的主要層粘連蛋白受體），以及reelin，共有幾個常見的缺陷，如皮層邊緣區(qū)異位生長和徑向回縮（Beggs等人，2003; Georges-Labouesse等人，1998; Hartmann等，1998; Niewmierzycka等，2005），但對祖細胞增殖或細胞命運決定沒有任何干擾（Haubst et al，2006）。使用神經(jīng)球試驗的功能研究雖然調(diào)查了β1整合素在NSC /前體細胞中的作用， 但無法揭示NSC中正常細胞與細胞，細胞與ECM的相互作用，并沒有提供β1整合素在這些細胞中的角色。使用抗體阻斷β1整合素導致NSC維持受損（Campos等人，2004），但是隨后從缺乏β1整合素的細胞生長出來的神經(jīng)球?qū)嶒灈]有顯示類似的缺陷（Leone等，2005）。在相似的體外測定中，使用軟骨素酶ABC對硫酸軟骨素蛋白聚糖進行降解，導致增殖和神經(jīng)元分化收到干擾，揭示了這些ECM分子在調(diào)節(jié)NSC /前體細胞行為中的作用（Sirko等，2007）

1.2.5 血管和腦脊液

VZ / SVZ微環(huán)境受到腦脊液和CNS發(fā)育早期階段形成的血管的影響。小鼠血管形成早于E9（Herken等，1989; Vasudevan等，2008），證據(jù)表明，神經(jīng)發(fā)生和血管生成由常見信號調(diào)節(jié)，包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），Notch和Shh （Carmeliet，2003）。體外研究顯示，E10神經(jīng)干/前體細胞與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)導致更大克隆的形成和更少的神經(jīng)元產(chǎn)生，這源于對稱的增殖分裂（Shen et al。，2004），但相關的影響因素仍然未知。CSF在發(fā)育階段的成分和作用仍然缺乏研究。在zui近的一項研究中，CSF在雞胚體內(nèi)的流動被擾動，導致異常的皮質(zhì)發(fā)育（Mashayekhi和Salehi，2006），而其他實驗工作表明CSF來源的因子可以調(diào)節(jié)體外的神經(jīng)干/前體細胞行為（Gato et al，2005; Miyan等，2006）。zui近的研究工作也顯示，分裂的神經(jīng)干細胞，脫落出富含 prominin-1的囊泡到腦脊液中，盡管其作用仍有待確定，但這些可能提供額外的線索（Marzesco等，2005）。