精品国产亚洲国产亚洲,久热中文在线观看精品视频,成人三级av黄色按摩,亚洲AV无码乱码国产麻豆

將體外轉(zhuǎn)錄的 RNA 用作治療藥物需要大量具有低免疫原性的功能性 RNA。用于合成這些體外轉(zhuǎn)錄的 mRNA 的技術——主要使用 T7 噬菌體 RNA 聚合酶 (T7 RNAP)，這個技術目前已經(jīng)很成熟。T7 RNAP 從包含噬菌體酶特異性啟動子的 DNA 模板中以高保真度轉(zhuǎn)錄 RNA。盡管使用 T7 RNAP 從 DNA 模板合成 RNA 的過程很穩(wěn)健，但之前的研究已經(jīng)確定了體外合成過程中某些副產(chǎn)物的存在，這些副產(chǎn)物會觸發(fā)細胞免疫反應，包括雙鏈 RNA (dsRNA)，這已被證明成為免疫通路的主要觸發(fā)因素。因此，在為尋求最小化細胞免疫反應的體內(nèi)應用合成 mRNA 時，從 mRNA 制劑中消除這些 dsRNA 污染物或減少它們的形成是至關重要的。

01

這些dsRNA副產(chǎn)物是什么？

dsRNA 副產(chǎn)物的產(chǎn)生被認為主要通過兩種不同的機制發(fā)生。首先，由 T7 RNAP 合成的 RNA 轉(zhuǎn)錄本（runoff轉(zhuǎn)錄本，圖1）在后續(xù)幾輪轉(zhuǎn)錄中作為 T7 RNAP 的 RNA 依賴性 RNA 聚合酶活性的模板^[1]。如果runoff轉(zhuǎn)錄本的 3'-末端具有足夠的互補性（在順式中），它將向后折疊并導致runoff轉(zhuǎn)錄本的延伸。生成的 RNA 將在 3' 端延伸，并且可以在凝膠上的變性條件下與主要轉(zhuǎn)錄物區(qū)分開來（圖2A）。

圖1 體外轉(zhuǎn)錄過程中 dsRNA 副產(chǎn)物形成的可能機制示意圖

短的 RNA 片段，例如流產(chǎn)的轉(zhuǎn)錄物，可以退火到runoff轉(zhuǎn)錄物中的互補序列（反式），并且還會導致 dsRNA 副產(chǎn)物的形成（圖1B）。dsRNA 產(chǎn)物的身份和性質(zhì)將根據(jù)延伸發(fā)生在順式還是反式而有所不同，并且預計 RNA 積累與虛假產(chǎn)物的形成之間存在很強的相關性，因為合成的 RNA可能會重新結(jié)合聚合酶以啟動延伸。

第二種dsRNA 副產(chǎn)物機制是RNAP 可能會切換到非模板鏈，從而產(chǎn)生與runoff產(chǎn)物互補但以啟動子獨立方式合成的 RNA 分子（圖1C）^[2]。由于反義分子的大小與runoff產(chǎn)物的大小相似，因此無法通過變性凝膠電泳進行區(qū)分。相反，分析由于存在反義 RNA 分子而形成的 dsRNA 副產(chǎn)物將需要天然條件（圖2B）。

02

如何檢測反應中的dsRNA副產(chǎn)物？

1）凝膠電泳法

以runoff轉(zhuǎn)錄本為模板、順式或反式形成的dsRNA，其長度短于runoff轉(zhuǎn)錄本，在變性凝膠下可與目標轉(zhuǎn)錄本區(qū)分（圖2A）。以DNA模板或非模板鏈為模板轉(zhuǎn)錄生成的runoff轉(zhuǎn)錄本或反義鏈，二者結(jié)合形成的dsRNA長度與runoff轉(zhuǎn)錄本一致，無法通過變性凝膠有效分離，可使用活性膠實現(xiàn)dsRNA與ssRNA的分離（圖2B）。兩種凝膠電泳法適用于不同副產(chǎn)物的定性檢測，分辨率相對較低，不能精確地定量分析dsRNA殘留量。

2）免疫印跡法

免疫印跡法利用dsRNA特異性抗體來檢測IVT反應中dsRNA含量。J2抗體是一種抗dsRNA抗體，可特異性識別并結(jié)合dsRNA，根據(jù)特定信號鑒別樣品中是否存在dsRNA（定性檢測），如圖2C所示。同時制備合適的標準對照品，以定量分析待測樣品的dsRNA殘留，提高檢測的靈敏度（圖2E）。該方法依賴于抗體對dsRNA的特異性識別作用，而mRNA二級結(jié)構(gòu)或修飾核苷酸可能改變抗體對dsRNA結(jié)構(gòu)的識別，需進行專門的研究。注意：抗體檢測的靈敏度與dsRNA區(qū)域的長度有關，需調(diào)整檢測的靈敏度以確保dsRNA可被檢測。

3）酶法免疫印跡法

是當前dsRNA檢測的常用方法，可采用尼龍膜或商業(yè)化酶聯(lián)免疫法（ELISA）試劑盒。使用尼龍膜上樣需優(yōu)化上樣體積，以使各樣品擴散程度一致，減少對結(jié)果精確度的影響。商業(yè)化試劑盒檢測過程相對簡單。以某ELISA試劑盒為例，基于雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法，使用捕獲抗體包被微孔板，形成固相抗體，向固相抗體微孔板中加入dsRNA校準品和待測樣品，然后加入檢測抗體，最后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的酶標二抗，形成“包被抗體-dsRNA-酶標檢測抗體"復合物，經(jīng)過洗滌后加入顯色液顯色，終止反應后使用酶標儀檢測吸光值，吸光值與樣品中dsRNA的量呈相關性。

4）MDA5特異結(jié)合法

胞質(zhì)免疫受體MDA5是一種RIG-I樣受體（RIG-I like receptors，RLRs），可特異性識別dsRNA從而激活機體的抗病毒免疫反應，因此可根據(jù)MDA5與dsRNA的結(jié)合作用設計體外檢測策略。首先，使用冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）可觀察到MDA5-dsRNA復合體存在短纖絲（filaments），對短纖絲結(jié)構(gòu)的分析顯示，每個MDA5分子橫跨14-15個RNA堿基對。但這一分析方法因低溫 EM 分析的設備要求而受到限制。其次，MDA5是一種ATP依賴性解旋酶，MDA5與dsRNA的結(jié)合可激活MDA5的腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）水解酶活性，可可以通過標準生化測定法檢測dsRNA。因此，在存在 MDA5 的情況下進行 ATP 水解的體外測定可能是了解目標 mRNA 產(chǎn)生的免疫反應程度的良好替代方法。

5）測序或質(zhì)譜分析

為深入研究dsRNA的核苷酸序列，可進行RNA-seq2或完整分子的質(zhì)譜分析（圖2D）。兩種方案的不足之處在于，RNA-seq分析過程中結(jié)構(gòu)化RNA的連接偏倚可能影響實驗結(jié)果，而質(zhì)譜分析提供所選RNA的異質(zhì)性分布，但無法提供RNA 3’端的序列信息。因此，兩種分析方法并不通用，且在篩選多個序列時不能以高通量的方式進行。

由于免疫測定無法區(qū)分 dsRNA 產(chǎn)物是由于 3' 端延伸還是反義分子合成而形成，因此建議實施不止一種方法來表征副產(chǎn)物的性質(zhì)，因為了解分子的性質(zhì)可以指導采取何種方法來防止在 IVT 反應中形成 dsRNA 副產(chǎn)物（見下一節(jié)）。

03

如何減少IVT反應中dsRNA副產(chǎn)物的形成？

1）高效液相色譜 (HPLC) 純化

高效液相色譜 (HPLC) 的純化已被證明可以將 dsRNA 副產(chǎn)物與主要 IVT RNA 產(chǎn)物分離（圖 3A）^[3]。HPLC 純化過程中 dsRNA 副產(chǎn)物的保留時間較長表明該方法可用于將 3'-擴展的 dsRNA 副產(chǎn)物與主要 IVT RNA 分離。這種方法雖然有效，但會導致 mRNA 合成工作流程中的額外步驟，涉及專門的儀器，與擴大反應不兼容，并阻礙了該方法的成本效益。

此外，尚不清楚這種基于 HPLC 的方法是否可以有效分離反義 dsRNA 產(chǎn)物，它們的分離可能取決于所使用的實驗條件。還報道了基于 dsRNA 與纖維素的選擇性結(jié)合，用于去除 dsRNA 污染物的基于纖維素的色譜方法^[4]。盡管這種純化策略具有成本效益，而且這種方法的一次性性質(zhì)可以防止先前純化的殘留，但它可能并不適合所有 mRNA 序列，因為某些 mRNA 可能更傾向于形成二級結(jié)構(gòu)這可能會降低恢復率。

2）使用耐熱 RNA 聚合酶進行IVT 反應

合成后純化的另一種方法是通過改變 IVT 反應條件來防止在中形成 dsRNA 副產(chǎn)物。降低 IVT 反應中的鎂含量以減少一些特定模板^[2]的 dsRNA 副產(chǎn)物（通過反義 RNA 的合成形成）的形成；然而，降低反應中的鎂濃度也會影響 RNA 的總產(chǎn)量，這對于需要大量 mRNA 的應用來說是不可取的。

最近表明，添加與runoff轉(zhuǎn)錄本 3' 端互補的 DNA 寡核苷酸也可以防止 3' 延伸的 dsRNA 副產(chǎn)物的形成^[5]，但在合成治療性 mRNA 后去除這種寡核苷酸可能具有挑戰(zhàn)性，并且需要額外的酶促步驟，這在試圖簡化工作流程和限制生產(chǎn)成本時是不可取的。

使用耐熱 RNA 聚合酶，例如來自 New England Biolabs 的 HiT7® 已被證明可以減少 IVT 反應中 3'-延伸的 dsRNA 副產(chǎn)物（圖 3B）的形成，而不影響總產(chǎn)量或RNA，并且它不需要額外的酶處理，這可以為當前的 IVT 反應工作流程提供替代方案^[6, 7]。

適合去除/預防 dsRNA 污染物的方法將取決于最終應用和所需的 RNA 產(chǎn)量規(guī)模。對于以放大為先決條件的應用，合成后純化步驟可能會阻礙最終結(jié)果。更好的方法是防止在合成過程中形成 dsRNA 副產(chǎn)物。

圖3 減少IVT 反應中 dsRNA 副產(chǎn)物。

04

未來展望

使用合成 mRNA 作為藥物需要 mRNA 不含任何污染 RNA，并且需要大量合成。因此，在選擇合適的方法去除 dsRNA 副產(chǎn)物以合成您喜歡的 mRNA 分子時，應盡早考慮 IVT 反應的最終應用和規(guī)模。dsRNA 副產(chǎn)物也是必須考慮的一個因素。例如，模板編碼的 poly-A 加尾可以避免部分 dsRNA 副產(chǎn)物的形成，但不是全部，高溫轉(zhuǎn)錄可以減少 3'-末端延伸的 dsRNA 副產(chǎn)物，但不能減少反義 RNA 的合成^[7]。使用高產(chǎn)率反應條件來合成更大量的 RNA 對于需要放大的應用來說很有吸引力。然而，由于在存在過量 RNA 的情況下可以增強某些 dsRNA 副產(chǎn)物的形成，因此應考慮酶：模板：NTP 條件，并針對每個序列進行優(yōu)化，盡可能地減少這些 dsRNA 副產(chǎn)物的形成。DNA 模板或 RNA 分子中更容易形成 dsRNA 副產(chǎn)物的序列的性質(zhì)尚不清楚。

更好地了解序列特異性有助于 mRNA 3'-末端的合理設計，以防止在反應中形成這些污染物。即使是模板序列和/或反應條件的微小變化也可能影響 dsRNA 副產(chǎn)物形成的程度，在設計/修改模板序列時應予以考慮。最后，在使用經(jīng)過修改的 NTP 制作 mRNA 時，很難檢測 dsRNA 副產(chǎn)物，在這種情況下，至少應采用一種以上的方法來表征和定量 dsRNA 副產(chǎn)物。

總之，用于治療目的的合成 mRNA 的高效且具有成本效益的生產(chǎn)將需要對最終 mRNA 產(chǎn)品的性質(zhì)有透徹的了解，并且將取決于能夠最大限度地減少污染物產(chǎn)生的合成過程，否則將需要昂貴的純化方法。

【1】 Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin CT. 3’ end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character-RNA-Seq analyses. Nucleic Acids Res. 2018 Oct 12;46(18):9253-9263.

【2】 Mu X, Greenwald E, Ahmad S, Hur S. An origin of the immunogenicity of in vitro transcribed RNA. Nucleic Acids Res. 2018 Jun 1;46(10):5239-5249.

【3】 Karikó K, Muramatsu H, Ludwig J, Weissman D. Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA. Nucleic Acids Res. 2011 Nov;39(21):e142.

【4】 Baiersd?rfer M, Boros G, Muramatsu H, Mahiny A, Vlatkovic I, Sahin U, Karikó K. A Facile Method for the Removal of dsRNA Contaminant from In Vitro-Transcribed mRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 2019 Apr 15;15:26-35.

【5】 Gholamalipour Y, Johnson WC, Martin CT. Efficient inhibition of RNA self-primed extension by addition of competing 3’-capture DNA-improved RNA synthesis by T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 2019 Aug 8. pii: gkz700. doi: 10.1093/nar/gkz700.

【6】 Roy B, Robb GB. Use of thermostable RNA polymerases to produce RNAs having reduced immunogenicity. US Patent 10,034,951.

【7】 Wu MZ, Asahara H, Tzertzinis G, Roy B. Synthesis of low immunogenicity RNA with high-temperature in vitro transcription.

酶產(chǎn)品

工具RNA

核酸電泳產(chǎn)品

ELISA檢測相關試劑盒

Absin特色產(chǎn)品線：
WB相關：ECL發(fā)光液、預染marker、預制膠；IHC相關：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標簽抗體、對照抗體；定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...