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2021年9月20日，貝克曼研究所基因治療中心的研究團(tuán)隊(duì)在Nature子刊Nature Communications上發(fā)表了題為“Exosome-mediated stable epigenetic repression of HIV-1"的研究論文。

該研究開發(fā)出了一種靶向HIV-1啟動(dòng)子的鋅指蛋白（ZFP-362），該蛋白與 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A的活性結(jié)構(gòu)域融合，以誘導(dǎo)長(zhǎng)期穩(wěn)定的HIV-1表觀遺傳抑制。通過(guò)外泌體遞送這種抑制性蛋白的mRNA，能夠在體內(nèi)抑制小鼠骨髓、脾臟和大腦中的 HIV 水平，并阻止其復(fù)制。這項(xiàng)研究為外泌體介導(dǎo)的治療性藥物系統(tǒng)遞送平臺(tái)以表觀遺傳方式抑制 HIV-1 感染鋪平了道路。

為了實(shí)現(xiàn)對(duì) HIV-1 的穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄抑制，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種表達(dá)重組融合蛋白 ZFP 362b-DNMT3A（ZD3A）的載體，它可以借助嵌入的核定位信號(hào)（NLS）定位到細(xì)胞核。該 ZFP 能夠與 HIV-1 的 LTR 啟動(dòng)子內(nèi)的 NF-kB 雙聯(lián)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，并與 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 3 結(jié)構(gòu)域（3A）融合以生成（ZD3A）。長(zhǎng)期感染 HIV-1 的 Jurkat 細(xì)胞（CHI-Ju）在轉(zhuǎn)染了 ZD3A 后 HIV-1 轉(zhuǎn)錄物表達(dá)顯著降低，并且一直被穩(wěn)定抑制。

接下來(lái)，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了幾個(gè)具有各種阻遏結(jié)構(gòu)域的 ZFP362 融合構(gòu)建體，包括與PWWP、ADD 和甲基轉(zhuǎn)移酶的活性域融合成為的 ZPAMt，以及與 KRAB 和甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域融合的ZKMt。ZPAMt和ZKMt有效地抑制了病毒表達(dá)。

圖1 ZFP 362b-DNMT3A有效抑制 HIV-1 表達(dá)

為了確定觀察到的沉默所涉及的作用機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)用 ZPAMt 和 ZKMt 轉(zhuǎn)染細(xì)胞并行免疫沉淀，證實(shí)了ZFP-362與 HIV-1 啟動(dòng)子的結(jié)合。在轉(zhuǎn)染的 CHI-Ju 細(xì)胞中，研究團(tuán)隊(duì)觀察到Gag RNA 的有效抑制，并通過(guò)甲基 DNA 免疫沉淀測(cè)定法檢測(cè)到相對(duì)于對(duì)照HIV-1 LTR 區(qū)域 CpG 甲基化的靶向富集。這些數(shù)據(jù)證實(shí)觀察到的抑制是ZPAMt 和 ZKMt 將 DNA 甲基化定向到 HIV-1 LTR 的結(jié)果。

圖2 ZPAMt 和 ZKMt 占據(jù)并甲基化 HIV-1 LTR 啟動(dòng)子并以難以激活的長(zhǎng)期方式抑制病毒表達(dá)

最后，為了確定 ZPAMt 的抗病毒功效，研究團(tuán)隊(duì)將 HIV-1 感染的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）植入到人源化免疫缺陷小鼠，然后對(duì)其進(jìn)行兩周的cART治療以及ZPAMt注射。結(jié)果顯示， ZPAMt 顯顯著穩(wěn)定抑制了 HIV-1 表達(dá)，機(jī)制在于5'LTR的顯著甲基化。最重要的是，ZPAMt 沒有產(chǎn)生任何長(zhǎng)期毒性。

圖3 外泌體包裝的 ZPAMt 在體內(nèi)抑制病毒表達(dá)

綜上所述，這項(xiàng)工作證明了通過(guò)外泌體遞送重組ZPAMt可以靶向HIV-1，使之表觀遺傳沉默，并在病毒感染的細(xì)胞中誘導(dǎo)抑制表型。該遞送系統(tǒng)為未來(lái)開發(fā)抑制HIV的療法鋪平了道路。

[1] Shrivastava S, Ray RM, Holguin L, Echavarria L, Grepo N, Scott TA, Burnett J, Morris KV. Exosome-mediated stable epigenetic repression of HIV-1. Nat Commun. 2021 Sep 20;12(1):5541. 

表1 本期小愛推薦1—線性mRNA

表2 本期小愛推薦2—環(huán)狀mRNA

表3 本期小愛推薦3——mRNA專用轉(zhuǎn)染試劑