背景介紹
過量飲酒會導致肝臟氧化應激、脂肪堆積和炎癥。隨著酒精性肝病 (ALD) 在全球的流行，ALD的研究迅速增加。目前，許多研究試圖發(fā)現(xiàn)有效治療ALD的藥物，包括使用抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡和調節(jié)腸道微生物群的藥物。
甘油三脂檢測在ALD研究中的應用
肝脂積聚是酒精性肝病的主要病理特征之一。先前的研究表明，二甲雙胍通過抑制硬脂酰輔酶A脫飽和酶1 (SCD1) 或miR-33b的表達來抑制高糖和高胰島素誘導的肝細胞TG蓄積。還有研究表明，二甲雙胍可以通過激活AMPK信號通路逆轉脂肪肝。然而，其在ALD中的作用尚不清楚。
Xie等[1]采用一系列檢測手段探究了二甲雙胍調節(jié)酒精性肝病脂代謝的可能機制。其中甘油三酯 (TG) 檢測試劑盒(abs580085)用于檢測細胞內TG的濃度，以確定二甲雙胍對ALD的影響。
甘油三酯檢測試劑盒使用方法介紹
檢測原理：
甘油三酯 (TG) ，也稱為三酰甘油三酯或三酰甘油酯，是植物油和動物脂肪中的主要成分。在人體內，血液中甘油三酯的高水平與動脈粥樣硬化、心臟病和胰腺炎有關。試劑盒檢測原理是利用脂肪酶對甘油三酯進行水解，產生甘油和游離脂肪酸。隨后通過偶聯(lián)酶促反應在500nm下比色讀數，測定釋放甘油的量，再換算成甘油三酯的含量。
試劑盒組分 | 規(guī)格 | 儲存條件 |
96-Well Microplate | 1 plate | — |
Diluent | 20 mL × 1 | 4 ℃ |
Enzyme | Powder × 1 | -20 ℃ |
Dye Reagent | Powder × 1 | -20 ℃ |
Standard (5 mmol/L) | 1 mL × 1 | 4 ℃ |
Plate Adhesive Strips | 3 Strips | — |
Technical Manual | 1 Manual | — |
備注：
1、Enzyme：使用前加入9mL Diluent溶解；
2、Dye Reagent：使用前加入10mL Diluent溶解；
3、Assay Buffer（未提供）：例如制備100mL緩沖液，請將35mL庚烷和65mL異丙醇混合在一起。
操作步驟：
1、試劑和材料
1）自備試劑：Assay Buffer（例如制備100mL緩沖液，請將35mL庚烷和65mL異丙醇混合在一起。）
2）自備材料：酶標儀、蒸餾水、移液器與槍頭、離心機、計時器等。
2、樣品處理
1）細胞/細菌樣品：細胞/細菌（5×106個）離心后棄上清，加入1mL緩沖液，超聲處理（功率20%，超聲處理3s，間隔10s，重復30次）后，4℃、10000g離心10min，取上清轉移至新離心管中，置于冰上待檢測；
2）組織樣品：稱取0.1g組織，加入1mL緩沖液，冰上勻漿后，4℃、10000g離心10min，將上清液轉移至新的離心管中，置于冰上待檢測；
3）血清/血漿樣品：直接置于冰上待檢測。
3、標準曲線制備
用蒸餾水對試劑盒提供的標準品（5mmol/L）進行2倍連續(xù)稀釋，形成標準曲線。
4、樣品預實驗
對于未知的樣品，濃度可能在很大的范圍內變化。建議多做幾個稀釋梯度進行預實驗，以確保讀數在標準曲線范圍內。
5、樣品檢測
按照以下方式加樣完成后，蓋上板膠帶，混合均勻。將96孔板放入37℃的烘箱中反應10min，隨后用酶標儀在500nm下檢測吸光值。
試劑 | 樣品孔 | 標準品孔 | 空白孔 |
樣品 | 10μL | — | — |
標準品 | — | 10μL | — |
蒸餾水 | — | — | 10μL |
Enzyme | 90μL | 90μL | 90μL |
Dye Reagent | 100μL | 100μL | 100μL |
6、樣品濃度計算
樣品濃度計算試劑盒說明書中提供兩種計算方式：標準曲線法、公式法。
針對說明書既有計算公式又有標曲的試劑盒，兩種方式任選一種就可以，公式是簡便算法。建議按照標曲計算，雖然比較麻煩且耗費試劑，但檢測結果會更加準確。按照標曲計算，每一次都需要重新做標曲，因為這種反應是一個變化的過程，檢測的數值會隨著反應時間、溫度等產生變化。
圖 甘油三酯檢測標準曲線示例（檢測限：0.1mmol/L-5mmol/L）
常見問題解答
Q1：我想要檢測肝臟細胞在處理后，合成甘油三酯的能力是否改變，我的理解是一方面要檢測細胞內的甘油三酯，另一方面也要檢測細胞分泌到培養(yǎng)液中的甘油三酯，那么我是不是應該把我處理后的細胞沉淀收取，培養(yǎng)上清也一并保留，這么理解對嗎？
A1：理論上是的，既然既要檢測細胞內的又要檢測分泌出來的，那肯定是要一并保留上清和細胞的。
Q2：如果是將細胞上清收集后檢測，那么按照細胞培養(yǎng)上清樣品的檢測方法，我的培養(yǎng)上清稀釋倍數是需要通過預實驗來確定嗎？
A2：稀釋倍數都是要通過預實驗來確定的。
Q3：Enzyme和Dye Reagent都是粉末狀，需要溶解，其中Dye Reagent說明書提示建議現(xiàn)用現(xiàn)配，那我如果想要做預實驗的話，這兩種試劑溶解后，都能夠放在-80℃保存嗎？
A3：這樣操作是對的，特別是酶，溶解后在-80 ℃保存最好。需要注意的是染料不管是低溫還是高溫都會氧化，建議老師預實驗做完盡早開展實驗，一次性多測些樣品，防止試劑溶解后長期儲存影響檢測效果。
Q4：TG試劑盒里面的檢測板可以拆分嗎？因為如果要做預實驗摸索稀釋倍數的話，可能只做幾個孔。
A4：板子不能拆分，但是可以用常規(guī)的96孔酶標板替代做預實驗。
Q5：該試劑盒可以檢測組織樣本，對組織樣本的保存有什么要求嗎？
A5：沒有什么特殊要求，新鮮或者液氮速凍的組織都可以。
參考文獻
[1] Xie F , Zhong Y , Wang D ,et al. Metformin protects against ethanol-induced liver triglyceride accumulation by the LKB1/AMPK/ACC pathway[J].Molecular biology reports, 2022,49(8):7837-7848.
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貨號 | 產品名稱 | 規(guī)格 | 檢測范圍 |
abs580039 | 乙醛脫氫酶檢測試劑盒 | 96T | 4μmol/L - 400μmol/L |
abs580082 | 脂肪酶檢測試劑盒 | 96T | 50mmol/L - 500mmol/L |
abs580083 | 乙醇脫氫酶檢測試劑盒 | 96T | 4μmol/L - 400μmol/L |
abs580084 | 丙酮酸脫羧酶檢測試劑盒 | 96T | 4μmol/L - 400μmol/L |
abs580085 | 甘油三酯(TG)檢測試劑盒 | 96T | 0.1mmol/L - 5mmol/L |
abs580112 | 高密度脂蛋白檢測試劑盒 | 96T | 0.1mmol/L - 10mmol/L |
abs580113 | 低密度脂蛋白檢測試劑盒 | 96T | 0.1mmol/L - 10mmol/L |
abs580114 | 總膽固醇(TC)檢測試劑盒 | 96T | 0.05mmol/L - 5mmol/L |
abs580130 | 乙酰輔酶A羧化酶檢測試劑盒 | 96T | 1μmol/L - 100μmol/L |
abs580141 | 游離脂肪酸檢測試劑盒 | 96T | 0.01mmol/L - 1mmol/L |
abs580209 | 甘油檢測試劑盒 | 96T | 0.1mmol/L - 10mmol/L |
abs580213 | 乙醇檢測試劑盒 | 96T | 0.01mg/L - 10mg/L |
abs580217 | 脂氧合酶(LOX)檢測試劑盒 | 96T | 0.03mmol/L - 3mmol/L |
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