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概述

免疫細胞培養(yǎng)的六個基本流程：樣本制備、細胞分選、分型鑒定、擴增&培養(yǎng)、質量優(yōu)化、后續(xù)研究。小愛已經給大家詳細介紹了《免疫細胞培養(yǎng)攻略之樣本制備（一）》和《免疫細胞培養(yǎng)攻略之細胞分選（二）》，《免疫細胞培養(yǎng)攻略之分型鑒定（三）》今天我們繼續(xù)一起學習擴增&培養(yǎng)的相關知識。

從樣本制備到細胞分選、分型鑒定，我們終于獲得了純度高、活性好的目的細胞之后，便需要在體外人工模擬其在體內的生長環(huán)境，同時保證無菌、適宜的溫度和pH，給予免疫細胞充足的營養(yǎng)使其不斷生長繁殖，這個過程便是擴增&培養(yǎng)，主要可分為培養(yǎng)體系建立、傳代流程、凍存和復蘇。

擴增&培養(yǎng)

1、培養(yǎng)體系建立：

不同免疫細胞涉及的細胞因子、激活信號大不相同，因此培養(yǎng)體系也不可同一而論；同一免疫細胞不同來源（如PBMC來源、臍帶血來源、iPSCs或ESCs）的具體培養(yǎng)方案也存在差別。小愛列舉了一些免疫細胞的培養(yǎng)體系以作參考，大家可以針對自己的實驗需求進行摸索和優(yōu)化，以獲得擴增效率高、細胞純度高、活性好的最佳培養(yǎng)方案。

（1）T細胞(human)的活化、增殖培養(yǎng)與分化：

T細胞的激活涉及到兩個信號：TCR/CD3與APC表面特異的MHC-多肽復合物結合產生的特異性抗原刺激信號；APC表面多對共刺激分子和T細胞相應受體作用后產生的非特異性的共刺激信號。最常見的用于T細胞體外活化的是Anti-CD3和Anti-CD28，在兩者的協(xié)同作用下，可使T細胞充分活化^[1]。此外，我們還需添加不同的細胞因子以誘導T細胞向不同的方向分化（圖1）。

圖1 細胞因子在T細胞中的調節(jié)和功能^[2]

1.將免疫細胞無血清培養(yǎng)基(abs9772)恢復至室溫，重懸分離后的T細胞，加入CD3/CD28磁珠(abs160019)（與細胞數(shù)量1:1），1%雙抗(abs9244)，促進T細胞活化和增殖；

2.加入300U/mL IL-2(abs04045)使其分化和增殖為效應T細胞；或5ng/mL IL-15促使T細胞分化和增殖為記憶T細胞^[3]。

以上是一篇文獻的T細胞分化方案，小愛也匯總了體外誘導T細胞分化的一些細胞因子（圖2），可供大家參考。

圖2 體外誘導T細胞分化方案^[4]

Tips：原代T細胞一般在體外的培養(yǎng)時間不超過三周，用于功能實驗的T細胞建議培養(yǎng)時間在14天以內。

（2）PBMC(human)來源的NK細胞體外擴增^[5]：

1.調整分離后的NK細胞密度為1*10⁶cells/mL，重懸至含有免疫細胞無血清培養(yǎng)基(abs9772)中；

2.加入200U/mLIL-2，10ng/mL IL-15和1*10⁶cells/mL的K562細胞（絲裂mei素處理滅活）。在15天的擴增過程中，每隔2-3天對NK細胞進行一次傳代，補充細胞因子和新鮮制備的K562細胞。

當然，PBMC(human)來源的NK細胞體外擴增的方法有很多：細胞因子?抗體融合、飼養(yǎng)細胞或膜顆粒。小愛也找到一篇24.1分的綜述，詳細列舉了不同擴增方案的培養(yǎng)基、添加物、培養(yǎng)天數(shù)、擴增效率、細胞純度，大家可以按需保存！

圖2 PBMC(human)來源的NK細胞體外擴增方案^[6]

（3）單核細胞(human)的培養(yǎng)以及誘導分化為巨噬細胞^[7]：

1.向免疫細胞無血清培養(yǎng)基(abs9772) 加入1%雙抗(abs9244)，10%胎牛血清優(yōu)級(abs972)，使用上述培養(yǎng)基將分離的單核細胞重懸，細胞密度為1x10⁶cells/mL，放入37°C、5%CO₂的培養(yǎng)箱中，等待1h左右使細胞貼壁；

2.單核細胞經培養(yǎng)后即開始分化為廣義M0巨噬細胞。接種后第三天，更換新鮮培養(yǎng)基并加入25ng/mL粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，以促進M1表型，或50ng/mL巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，以促進M2表型。第六天，可再次更換新鮮培養(yǎng)基并加入100ng/mL LPS和20ng/mL IFN-γ，使細胞極化為M1-巨噬細胞表型，或加入10ng/mL M-CSF和20ng/mL IL-4；繼續(xù)培養(yǎng)24h即可。

（4）樹突狀細胞的培養(yǎng)^[8]：

1.樹突狀細胞體外培養(yǎng)時一般不增殖，可在培養(yǎng)環(huán)境中存活1周或更長時間。如果細胞需要持續(xù)培養(yǎng)超過一夜，建議在免疫細胞無血清培養(yǎng)基(abs9772)添加500U/mL GM-CSF和500U/mL IL4，以確保維持DC表型。

2.樹突狀細胞在10ng/mL TNF-α、5ng/mL IL-1β、15ng/mL IL-6和10ug/mL前列腺素E2(Prostaglandin E2)或0.2U/mL肝素(Heparin)和50μg/mL血藍蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin)或0.2U/mL肝素(Heparin)中可分化為成熟的樹突狀細胞。

2、傳代流程

貼壁性好的免疫細胞

半貼壁性細胞和懸浮細胞

3、凍存與復蘇^[9]：

（1）凍存：在細胞密度達到10⁷cells/mL時可進行凍存，采用分步冷凍法。具體步驟如下：

1.懸浮細胞500g室溫離心10min收集細胞沉淀，貼壁細胞胰酶消化并終止后離心收集；

2.棄上清，凍存液重懸細胞沉淀，1mL分裝并做好標記；

3.將凍存管放置-20℃ 1h；-80℃過夜；轉移至液氮中進行長期保存。

（2）復蘇：

1.從液氮中取出細胞，37℃水浴快速解凍細胞；

2.將細胞轉移到含有12mL培養(yǎng)基的15mL離心管中；

3.500g室溫離心5min，棄上清；

4.加入培養(yǎng)基重懸細胞進行后續(xù)的培養(yǎng)。

Tips：復蘇的免疫細胞建議通過血細胞計數(shù)計算細胞懸液中的細胞數(shù)量，并通過臺盼藍染料測定細胞活力。

今天講解就到這了，下一個質量優(yōu)化，我們不見不散呀！大家如有細胞培養(yǎng)問題，歡迎一起交流哦！

參考文獻：

[1] Gunnlaugsdottir, B., Anti-CD28-induced co-stimulation and TCR avidity regulates the differential effect of TGF- 1 on CD4+ and CD8+ naive human T-cells.International Immunology, 2004. 17(1): p. 35-44.

[2] Dong, C., Cytokine Regulation and Function in T Cells.Annual Review of Immunology, 2021. 39(1): p. 51-76.

[3] Nguyen, D.N., et al., Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency.Nature Biotechnology, 2019. 38(1): p. 44-49.

[4] Sekiya, T. and A. Yoshimura, In Vitro Th Differentiation Protocol, in TGF-β Signaling. 2016. p. 183-191.

[5] Li, F., et al., CCL5-armed oncolytic virus augments CCR5-engineered NK cell infiltration and antitumor efficiency.Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2020. 8(1).

[6] Fang, F., et al., Advances in NK cell production.Cellular & Molecular Immunology, 2022. 19(4): p. 460-481.

[7] K. Plaisance-Bonstaff, C.F., D. Wyczechowska, et al., Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes.J Vis Exp, 2019(154): p. 10.3791/59967.

[8] Boudewijns, S., et al., Autologous monocyte-derived DC vaccination combined with cisplatin in stage III and IV melanoma patients: a prospective, randomized phase 2 trial.Cancer Immunology, Immunotherapy, 2020. 69(3): p. 477-488.

[9] Raulf, M., T Cell: Primary Culture from Peripheral Blood, in Allergy. 2019. p. 17-31.

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