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流程

類器官原代培養(yǎng)流程

準備工作

1、儀器設(shè)備

CO₂培養(yǎng)箱、雙人單面超凈臺、倒置顯微鏡、臺式冷凍離心機、水浴鍋(abs72023)或水浴搖床，醫(yī)用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪刀、眼科鑷。

2、試劑耗材

類器官原代

一、使用前準備

A.組織消化液準備

使用前將皮膚組織消化液Ⅰ從-20℃環(huán)境取出，放置室溫使其融化，待溶解后上下顛倒瓶身數(shù)次，使液體充分混勻；

皮膚組織消化液Ⅰ加入12.5mL類器官原代培養(yǎng)緩沖液，配置后，在標簽上記錄配制日期，于2-8℃冰箱避光保存；

注：皮膚組織消化液Ⅰ配制完成后，建議在1個月內(nèi)使用完。

B.配置含有5%FBS、1%青霉素-鏈霉素的類器官原代培養(yǎng)緩沖液作為中和液用于終止消化；

 注：本實驗所用離心管、槍頭等，需提前使用PBS-BSA潤洗液進行潤洗。

二、原代組織消化

1、將手術(shù)樣本環(huán)形包皮組織展平于10cm培養(yǎng)皿中，用含有1%青霉素-鏈霉素的類器官原代培養(yǎng)緩沖液浸泡，反復漂洗，去除殘留血液；

2、剔除組織的皮下結(jié)構(gòu)，如脂肪、血管等，漂洗數(shù)次；

3、將組織均勻剪成0.5-1.5cm左右大小方塊狀，再次漂洗，直至漂洗液清澈；

4、將清洗后小塊組織放入10mL新鮮配置的皮膚組織消化液Ⅰ中，表皮層朝下，置于4℃冰箱中過夜消化；

 注：建議消化時間為12-14h；

5、消化過夜后，用無菌鑷子輕輕牽拉，將包皮組織的表皮和真皮分離，收集表皮皮片；

6、用無菌眼科剪將表皮剪碎成糊狀，置入培養(yǎng)皿中；

7、加入3mL皮膚組織消化液Ⅱ，于37℃的培養(yǎng)箱中消化10min；

8、將培養(yǎng)皿置于顯微鏡下觀察消化情況；

注：可輕拍皿壁，鏡下見大量漂浮游離的細胞亮點，即證明消化過程完畢，否則可適當延長消化時間。

9、消化完成后，加入3mL含有5%FBS、1%青霉素-鏈霉素的類器官原代培養(yǎng)緩沖液終止消化；

10、反復輕柔吹打，使細胞團塊分散；

11、40μm細胞篩網(wǎng)過濾，過濾液收集至50mL離心管中；

12、4℃，300 x g，離心5min；

13、使用類器官原代培養(yǎng)緩沖液重懸細胞沉淀；

14、4℃，300 x g，離心5min；

15、離心后棄去上清，保留底部細胞沉淀；

16、按照4-0.6x10^6/mL的密度，加入適量的基質(zhì)膠并吹打混勻10-15次。

 注：此步驟速度要盡可能快，避免基質(zhì)膠溫度升高而凝固；吹打時注意不要產(chǎn)生氣泡；

17、按照50μL/孔的量，將基質(zhì)膠與類器官懸液滴加至24孔板中心成半球形狀；

注：種板時操作確保迅速，避免基質(zhì)膠溫度升高而凝固；

18、將培養(yǎng)板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中20min，放置過程中避免晃動培養(yǎng)板；

19、取出培養(yǎng)板，每孔加入wan全培養(yǎng)基500μL；

20、顯微鏡下觀察類器官種板情況，培養(yǎng)板放入37℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

類器官傳代

一、使用前準備

A.類器官wan全培養(yǎng)基和傳代消化液分裝；

1、使用前按照每次用量分別分裝wan全培養(yǎng)基和類器官消化液；

2、在配制好的wan全培養(yǎng)基和標簽上記錄配制日期，于2℃-8℃冰箱避光保存；

3、在配制好的消化液標簽上記錄配制日期，于-20℃冰箱避光保存；

注：建議wan全培養(yǎng)基在1-3個月內(nèi)使用完；

B.基質(zhì)膠

使用前將基質(zhì)膠置于冰上或2℃-8℃冰箱2-3h解凍；

注：使用過程中保持基質(zhì)膠在4℃以下（建議置于冰上保存），溫度升高會致基質(zhì)膠凝固而不可使用。

C.潤洗

類器官操作過程中，所有離心管、槍頭操作前均需潤洗，避免類器官貼壁丟失；

二、傳代步驟

類器官培養(yǎng)6-7天或者類器官直徑大于100μm，可進行傳代培養(yǎng)，傳代前從培養(yǎng)箱內(nèi)取出24孔板，放置倒置顯微鏡下觀察有無污染或異常。

1、取50mL類器官傳代培養(yǎng)緩沖液放于冰上預冷；

2、取出培養(yǎng)板，在生物安全柜中沿孔邊緣吸去舊培養(yǎng)基；

3、每孔加入500uL類器官傳代培養(yǎng)緩沖液，反復吹打使基質(zhì)膠從板底脫落，將類器官轉(zhuǎn)移至15mL離心管，用預冷類器官傳代培養(yǎng)緩沖液定容至10mL；

4、使用1000μL槍頭溫和吹打混勻20-30次，使類器官從基質(zhì)膠中洗脫出來，4℃放置40min或-20℃冷凍3-5min；

5、4℃，400 x g，離心5min；

6、離心結(jié)束棄上清及上層基質(zhì)膠，保留細胞沉淀；向管內(nèi)加入新的預冷類器官傳代培養(yǎng)緩沖液6mL，1000μL槍頭溫和吹打混勻20-30次；

7、4℃，400 x g，離心5min；

8、離心后棄去上清，保留細胞沉淀，向離心管中加入2mL類器官傳代消化液，用1000μL槍頭溫和吹打混勻，室溫消化3-7min（期間用吹打混勻1-2次），用預冷類器官傳代培養(yǎng)緩沖液定容至6mL；

 注：消化并吹打結(jié)束后可取樣鏡下觀察類器官消化情況，以類器官消化成單個細胞為宜；棄上清時操作要小心，避免吸液時類器官丟失；

9、4℃，400 x g，離心5min；

10、離心后棄去上清，保留底部細胞沉淀；

11、按照4-0.6x10^6/mL的密度，加入適量的基質(zhì)膠并吹打混勻10-15次。

 注：此步驟速度要盡可能快，避免基質(zhì)膠溫度升高而凝固；吹打時注意不要產(chǎn)生氣泡；

12、按照50μL/孔的量，將基質(zhì)膠與類器官懸液滴加至24孔板中心成半球形狀；

注：種板時操作確保迅速，避免基質(zhì)膠溫度升高而凝固；

13、將培養(yǎng)板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中20min，放置過程中避免晃動培養(yǎng)板；

14、取出培養(yǎng)板，每孔加入wan全培養(yǎng)基500μL；

15、顯微鏡下觀察類器官種板情況，培養(yǎng)板放入37℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

類器官凍存

一、使用前準備

A.類器官凍存液和消化液分裝

1、使用前按照每次用量分別分裝凍存液和類器官消化液；

2、分別在配制好的凍存液和消化液標簽上記錄配制日期，于-20℃冰箱避光保存；

B.潤洗

類器官操作過程中，所有離心管、槍頭操作前均需潤洗，避免類器官貼壁丟失。

二、凍存步驟

類器官培養(yǎng)6-7天或者類器官直徑大于50μm，可進行類器官凍存，凍存前從培養(yǎng)箱內(nèi)取出24孔板，放置倒置顯微鏡下觀察有無污染異常。

1、取50mL類器官傳代培養(yǎng)緩沖液放于冰上預冷；

2、取出培養(yǎng)板，在生物安全柜中沿孔邊緣吸去舊培養(yǎng)基；

3、每孔加入500uL類器官傳代培養(yǎng)緩沖液，反復吹打使基質(zhì)膠從板底脫落，將類器官轉(zhuǎn)移至15mL離心管，用預冷類器官傳代培養(yǎng)緩沖液定容至10mL；

4、使用1000μL槍頭溫和吹打混勻20-30次，使類器官從基質(zhì)膠中洗脫出來，4℃放置40min或-20℃冷凍3-5min；

5、4℃，400 x g，離心5min；

6、離心結(jié)束棄上清及上層基質(zhì)膠，保留細胞沉淀；向管內(nèi)加入新的預冷類器官傳代培養(yǎng)緩沖液5mL，1000μL槍頭溫和吹打混勻20-30次；

7、4℃，400 x g，離心5min；

8、離心后棄去上清，保留細胞沉淀，向離心管中加入2mL類器官傳代消化液，用1000μL槍頭溫和吹打混勻，室溫消化3-7min（期間用吹打混勻1-2次），用預冷類器官傳代培養(yǎng)緩沖液定容至6mL；

 注：消化并吹打結(jié)束后可取樣鏡下觀察類器官消化情況，以類器官消化成單個細胞為宜；棄上清時操作要小心，避免吸液時類器官丟失；

9、4℃，400 x g，離心5min；

10、離心后棄去上清，保留底部細胞沉淀；

11、按照0.5x10^6cell/Vial（用戶可根據(jù)需求決定凍存密度）向離心管中添加類器官凍存液；

12、充分混勻后，將懸液分裝至細胞凍存管(1mL/Vial)；

13、放至程序性降溫盒，并轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱，次日將類器官轉(zhuǎn)移至液氮罐長期保存。

類器官復蘇

一、使用前準備

A.wan全培養(yǎng)基分裝

1、使用前按照每次用量分裝wan全培養(yǎng)基；

2、在配制好的wan全培養(yǎng)基標簽上記錄配制日期，于2℃-8℃冰箱避光保存；

注：建議wan全培養(yǎng)基在1-3個月內(nèi)使用完；

B.基質(zhì)膠

使用前將基質(zhì)膠置于冰上或2℃-8℃冰箱2-3h解凍；

注：使用過程中保持基質(zhì)膠在4℃以下（建議置于冰上保存），溫度升高會致基質(zhì)膠凝固而不可使用。

C.潤洗

類器官操作過程中，所有離心管、槍頭操作前均需潤洗，避免類器官貼壁丟失。

二、復蘇步驟

復蘇操作從凍存管解凍至放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過程控制在30min內(nèi)，以確保足夠的類器官存活。

1、準備低溫、低速離心機一臺，并將溫度設(shè)定為4℃預冷；

2、加樣槍頭提前放置-20℃預冷，于加樣前取出；24孔板提前放入37℃恒溫培養(yǎng)箱預熱；

3、基質(zhì)膠提前放置冰上或4℃冰箱解凍；

4、15mL無菌離心管用PBS-BSA潤洗液潤洗后置于冰上預冷；

5、將wan全培養(yǎng)基從冰箱中取出，將溫度平衡至室溫；

6、將類器官從液氮存儲管中取出，迅速將凍存管放入37℃水浴快速晃動1-2min，待凍存管內(nèi)大部分冰塊融化后取出；

注：從液氮罐取出類器官時，請嚴格按照實驗室生物安全管理規(guī)定，做好防凍傷防護措施；

7、將凍存管放置于冰上，帶入細胞間，用酒精棉球?qū)鼙谶M行消毒后，在生物安全柜中將類器官懸液轉(zhuǎn)移至預冷的15mL離心管內(nèi)，加入5mL類器官傳代培養(yǎng)緩沖液，使用潤洗后的1000μL移液槍頭輕輕吹打10次混勻；

8、4℃ ，300 x g 離心5min；離心后棄去上清保留沉淀；

注：離心后，仔細觀察離心管底部，有一白色薄層沉淀，避免吸液時丟失類器官。

9、向離心管中加入600μL預冷的基質(zhì)膠，輕輕混勻10-15次；

注：此步驟速度要盡可能快，避免基質(zhì)膠溫度升高而凝固；吹打時注意不要產(chǎn)生氣泡；請根據(jù)細胞量適當調(diào)整密度；

10、按照50μL/孔的量，將基質(zhì)膠與類器官懸液滴加至24孔板中心成半球形狀；

注：種板時操作確保迅速，避免基質(zhì)膠溫度升高而凝固；

11、將培養(yǎng)板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育40min，放置過程中避免晃動培養(yǎng)板；

12、孵育完成后取出培養(yǎng)板，每孔加入wan全培養(yǎng)基500μL；

13、顯微鏡下觀察類器官復蘇情況，培養(yǎng)板放入37℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；

14、類器官換液：每2天更換一次新鮮培養(yǎng)基。

注：接種后每日觀察，整個操作應(yīng)遵守無菌操作規(guī)程。

今天講解就到這了，大家如有實驗問題，歡迎一起交流哦！

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