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IPS誘導(dǎo)腸類器官培養(yǎng)攻略(第二階段)

閱讀:144      發(fā)布時間:2025-3-11
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IPS誘導(dǎo)腸類器官培養(yǎng)分為三大階段:人多能干細胞的培養(yǎng)、內(nèi)胚層分化中/后腸模式化誘導(dǎo)、類器官培養(yǎng)。

 

內(nèi)胚層分化中/后腸模式化誘導(dǎo)

 

一、前期準備

 

1、試劑與設(shè)備

 

   - 細胞:H1/H9 hESC或患者來源iPSCs。  

   - 培養(yǎng)基:人多能干細胞培養(yǎng)基(abs9403)、RPMI 1640(abs9484)。

   - 消化液:人多能干細胞消化液(abs9409)

   - 培養(yǎng)基添加劑:L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(2mM)(abs9295)、雙抗(abs9244)

   - 生長因子:Activin A(100ng/mL)(abs05801)、FGF4(500ng/mL)(abs06269)、WNT3a(500ng/mL)(abs05632)。  

   - 基質(zhì)膠:即用型基質(zhì)膠(培養(yǎng)板包被)(abs9410)、類器官專用基質(zhì)膠(abs9495)。

   - 血清:透析胎牛血清(abs945)

   - 關(guān)鍵設(shè)備:表面培養(yǎng)皿、立體顯微鏡、無菌手術(shù)刀、預(yù)冷微量離心管。 

 

2、試劑配制

 

   - 內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基:  

     - Day1:RPMI 1640+L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(2mM)+雙抗(1%)+Activin A(100ng/mL)。  

     - Day2:Day1配方+透析胎牛血清(0.2%)。  

     - Day3:Day1配方+透析胎牛血清(2%)。  

 

   - 中/后腸分化培養(yǎng)基:

     -RPMI 1640+透析胎牛血清(2%)+FGF4(500ng/mL)+WNT3a(500ng/mL)。

 

二、hPSCs傳代與鋪板

 

1、細胞傳代(耗時2h)  

 

   - 使用人多能干細胞消化液消化hPSCs至邊緣卷起。  

   - 用細胞刮刀輕柔剝離細胞團,反復(fù)吹打至1-2mm大小細胞團。  

   - 按1:6比例接種至Matrigel包被的24孔板(每孔約5000個細胞團)。  

   - 輕敲培養(yǎng)板使細胞均勻分布,37°C過夜培養(yǎng)。  

 

2、細胞擴增至85-90%融合(3-4天)  

   - 每日更換人多能干細胞培養(yǎng)基,觀察細胞密度。  

   - 關(guān)鍵:密度過高(自發(fā)分化)或過低(分化效率低)需重新鋪板。

 

三、內(nèi)胚層分化(3天)

 

1、Day1:吸除人多能干細胞培養(yǎng)基,加入Day1內(nèi)胚層培養(yǎng)基(無血清),培養(yǎng)24h。  

2、Day2:更換為Day2內(nèi)胚層培養(yǎng)基(含0.2%透析胎牛血清),培養(yǎng)24h。  

3、Day3:更換為Day3內(nèi)胚層培養(yǎng)基(含2%透析胎牛血清),培養(yǎng)24h。  

4、驗證分化效率(可選):  

   - 免疫染色檢測FOXA2/SOX17雙陽性細胞(效率應(yīng)達85-90%)。

 

四、中/后腸模式化(3-4天)

 

1、誘導(dǎo)球狀體形成

   -吸除內(nèi)胚層培養(yǎng)基,加入中/后腸分化培養(yǎng)基,每日更換。  

   -48h后:立體顯微鏡下觀察上皮增厚,72-96h球狀體(spheroids)脫離單層細胞。  

 

2、收集球狀體

   -用200μL槍頭收集游離球狀體,每管約50個,置于冰上備用。

  

本期小愛推薦



貨號

品名

規(guī)格

abs9403

人多能干細胞培養(yǎng)基

500ml

abs9409

人多能干細胞消化液

100mL

abs9295

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(100×,200mM)

100mL

abs9412

ES/iPS細胞凍存液

100mL

abs9410

即用型基質(zhì)膠

100mL

abs9484

RPMI 1640

500mL

abs9244

雙抗

100mL

abs05801

Activin A

10ug

abs06269

FGF4

50ug

abs05632

WNT3a

50ug

abs9495

基質(zhì)膠(低因子、無酚紅)

1.5ml*8

abs945

透析胎牛血清

500mL

abs9545

人正常腸類器官培養(yǎng)試劑盒

1kit

abs7289

2mL低溫金屬冰盒(24孔,平底)

1個

abs7033

細胞培養(yǎng)板(標(biāo)準透明6孔板)

50個/箱

abs7035

細胞培養(yǎng)板(標(biāo)準透明24孔板)

1箱

abs7164

細胞凍存管

1箱

abs7053

10mL一次性移液管

1箱

abs7054

25mL一次性移液管

1箱




 

Absin產(chǎn)品線:

爆款產(chǎn)品:試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測);細胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠,胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細胞因子)、分化試劑盒;分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒);化合物大包裝;輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...

特色產(chǎn)品:雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...

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