使用磷酸化抗體時，需要注意以下事項以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性：
樣本處理：
加入抑制劑：在裂解緩沖液（lysis buffer）中必須加入蛋白酶抑制劑和適量的磷酸酶抑制劑，以抑制組織或細(xì)胞裂解過程中釋放的內(nèi)源性蛋白磷酸酶，防止磷酸化蛋白去磷酸化，從而維持蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。
確保裂解：建議使用裂解液裂解結(jié)合超聲處理，確保細(xì)胞充分裂解并剪切染色質(zhì)DNA。超聲處理時應(yīng)保持低溫，避免蛋白降解。
新鮮樣本：使用新鮮制備的樣本，避免反復(fù)凍融，以減少磷酸基團(tuán)的降解。
抗體孵育：
低溫孵育：一抗孵育最好在4°C下進(jìn)行，并過夜孵育，以確保抗體與目的蛋白充分結(jié)合。低溫有助于維持抗體與抗原的物理吸附，防止高溫下抗原脫落。
稀釋液選擇：根據(jù)產(chǎn)品說明書推薦的稀釋液稀釋抗體，通常建議使用含5%牛血清白蛋白（BSA）的TBST稀釋液，而非含脫脂牛奶的TBST，因為脫脂牛奶中可能含有磷酸化蛋白，影響實驗結(jié)果。
洗滌條件：
洗滌液選擇：推薦使用TBST作為洗滌液，相對于PBST，TBST能提供更強的信號。
洗滌次數(shù)和時間：洗滌次數(shù)和時間需要優(yōu)化，以避免信號減弱或背景增加。通常建議一抗和二抗孵育后，用TBST洗膜3次，每次5分鐘。
封閉條件：
封閉劑選擇：雖然網(wǎng)絡(luò)上流傳磷酸化抗體不適于用牛奶封閉的說法，但使用實驗級脫脂牛奶進(jìn)行室溫封閉1小時是有效的，且有助于降低非特異性結(jié)合。
封閉時間：避免膜封閉時間過長，以免掩蓋抗原表位，阻止抗體結(jié)合。
對照設(shè)置：
陽性對照：設(shè)置合適的陽性對照，以確認(rèn)抗體檢測到的特異性信號。
總蛋白和內(nèi)參對照：除了檢測磷酸化蛋白外，還應(yīng)檢測該蛋白的總表達(dá)量，以及使用普通內(nèi)參作為體系對照，保證上樣量一致。
實驗環(huán)境：
低溫環(huán)境：在整個實驗過程中，除超聲處理外，應(yīng)保持低溫環(huán)境，以防止磷酸化蛋白在室溫下被蛋白磷酸酶降解。
結(jié)果分析：
分子量比對：在壓片后，根據(jù)marker比對條帶的分子量，確認(rèn)檢測到的條帶是否正確。
曝光時間：優(yōu)化曝光或壓片時間，以避免背景過深或條帶過淺。
抗體質(zhì)量：
選擇高質(zhì)量抗體：確保使用的磷酸化抗體質(zhì)量可靠，并嚴(yán)格按照抗體說明書進(jìn)行操作。
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