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【應(yīng)用實(shí)例】線粒體動(dòng)力學(xué)檢測(cè)和表型分析
引言
新陳代謝是生物體內(nèi)進(jìn)行的化學(xué)變化的總稱，是生物最基本的生命活動(dòng)過(guò)程。細(xì)胞從環(huán)境汲取能量、物質(zhì)，在內(nèi)部進(jìn)行各種化學(xué)變化，維持自身高度復(fù)雜的有序結(jié)構(gòu)，保證生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。作為細(xì)胞的“能量工廠”，線粒體在維持能量穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用，可以調(diào)控蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、溶質(zhì)和代謝物產(chǎn)物的進(jìn)出，并保護(hù)細(xì)胞質(zhì)免受有害線粒體產(chǎn)物的影響。線粒體通過(guò)不斷的分裂和融合，維持線粒體形態(tài)、分布和數(shù)量，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，該過(guò)程被稱為線粒體動(dòng)力學(xué)。線粒體自噬是機(jī)體清除細(xì)胞內(nèi)功能異常的線粒體的過(guò)程，是線粒體質(zhì)量控制的主要機(jī)制。線粒體動(dòng)力學(xué)的病理改變可導(dǎo)致生物能量功能受損和線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，并與多種病理機(jī)制相關(guān)，包括缺血性心肌病，糖尿病，肺動(dòng)脈高壓，帕金森氏病，亨廷頓氏病，骨骼肌萎縮癥、阿爾茨海默病等。
線粒體大小和形狀取決于它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的位置以及不同細(xì)胞對(duì)能量的需求。當(dāng)線粒體發(fā)生損傷時(shí)，它的形態(tài)和完整性會(huì)發(fā)生改變，如線粒體的數(shù)量、大小、長(zhǎng)度和形狀等。線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的檢測(cè)對(duì)于了解線粒體的穩(wěn)態(tài)以及功能狀態(tài)有重要意義。
高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)非常適合進(jìn)行線粒體表型和結(jié)構(gòu)的研究。共聚焦成像和水鏡可以提高成像質(zhì)量并更好地顯示線粒體結(jié)構(gòu)，高內(nèi)涵的圖像分析工具可以幫助科研工作者獲得不同表型的數(shù)字特征，線粒體表型和結(jié)構(gòu)重排的分析模塊可用于線粒體動(dòng)力學(xué)為基礎(chǔ)的細(xì)胞研究。
結(jié)果展示：
使用不同濃度的化合物，包括氯喹（抑制線粒體循環(huán)），魚藤酮（氧化磷酸化抑制劑）和纈氨霉素（鉀離子載體）處理PC12（人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞）。將活細(xì)胞用線粒體染料MitoTracker Orange 和Hoechst 進(jìn)行染色，利用ImageXpress®Micro Confocal 系統(tǒng)（Molecular Devices）進(jìn)行成像，使用共聚焦模式和40X水鏡拍攝活細(xì)胞的圖像，分辨單個(gè)線粒體并檢測(cè)線粒體形態(tài)變化。使用 MetaXpress®高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件中的Custom Module Editor（自定義模塊編輯器）分析圖像，使用“Granularity”模塊和“Find Fibers”模塊識(shí)別圓形顆粒和細(xì)長(zhǎng)的線粒體（圖 1）。
圖1 線粒體形狀的表型分析。
圖 2 化合物對(duì)線粒體的作用。使用MitoTracker Orange對(duì)線粒體進(jìn)行染色（ 黃色 ），對(duì)照組（A）、纈霉素（B）、魚藤酮（C）。
表1 用圖3所示的曲線定量 EC50
Molecular Devices高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)適用于各種細(xì)胞模型中化合物的藥物開發(fā)或毒性評(píng)估。使用高內(nèi)涵成像和高級(jí)圖像分析的線粒體動(dòng)力學(xué)分析方法不僅可以量化線粒體的表型變化，而且這種多參數(shù)方法也可用于研究正常和病理結(jié)構(gòu)變化以表征疾病模型或復(fù)合效應(yīng)。
主要特點(diǎn)：
• 獲得高質(zhì)量的圖像，更好地顯示線粒體形狀和結(jié)構(gòu)的變化
• 以更有效、更精確的方式量化和測(cè)量線粒體的表型變化
• 了解疾病的機(jī)制并評(píng)估各種細(xì)胞模型中的化合物毒性
新陳代謝是生物體內(nèi)進(jìn)行的化學(xué)變化的總稱，是生物最基本的生命活動(dòng)過(guò)程。細(xì)胞從環(huán)境汲取能量、物質(zhì)，在內(nèi)部進(jìn)行各種化學(xué)變化，維持自身高度復(fù)雜的有序結(jié)構(gòu)，保證生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。作為細(xì)胞的“能量工廠”，線粒體在維持能量穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用，可以調(diào)控蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、溶質(zhì)和代謝物產(chǎn)物的進(jìn)出，并保護(hù)細(xì)胞質(zhì)免受有害線粒體產(chǎn)物的影響。線粒體通過(guò)不斷的分裂和融合，維持線粒體形態(tài)、分布和數(shù)量，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，該過(guò)程被稱為線粒體動(dòng)力學(xué)。線粒體自噬是機(jī)體清除細(xì)胞內(nèi)功能異常的線粒體的過(guò)程，是線粒體質(zhì)量控制的主要機(jī)制。線粒體動(dòng)力學(xué)的病理改變可導(dǎo)致生物能量功能受損和線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，并與多種病理機(jī)制相關(guān)，包括缺血性心肌病，糖尿病，肺動(dòng)脈高壓，帕金森氏病，亨廷頓氏病，骨骼肌萎縮癥、阿爾茨海默病等。
線粒體大小和形狀取決于它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的位置以及不同細(xì)胞對(duì)能量的需求。當(dāng)線粒體發(fā)生損傷時(shí)，它的形態(tài)和完整性會(huì)發(fā)生改變，如線粒體的數(shù)量、大小、長(zhǎng)度和形狀等。線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的檢測(cè)對(duì)于了解線粒體的穩(wěn)態(tài)以及功能狀態(tài)有重要意義。
高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)非常適合進(jìn)行線粒體表型和結(jié)構(gòu)的研究。共聚焦成像和水鏡可以提高成像質(zhì)量并更好地顯示線粒體結(jié)構(gòu)，高內(nèi)涵的圖像分析工具可以幫助科研工作者獲得不同表型的數(shù)字特征，線粒體表型和結(jié)構(gòu)重排的分析模塊可用于線粒體動(dòng)力學(xué)為基礎(chǔ)的細(xì)胞研究。
結(jié)果展示：
使用不同濃度的化合物，包括氯喹（抑制線粒體循環(huán)），魚藤酮（氧化磷酸化抑制劑）和纈氨霉素（鉀離子載體）處理PC12（人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞）。將活細(xì)胞用線粒體染料MitoTracker Orange 和Hoechst 進(jìn)行染色，利用ImageXpress®Micro Confocal 系統(tǒng)（Molecular Devices）進(jìn)行成像，使用共聚焦模式和40X水鏡拍攝活細(xì)胞的圖像，分辨單個(gè)線粒體并檢測(cè)線粒體形態(tài)變化。使用 MetaXpress®高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件中的Custom Module Editor（自定義模塊編輯器）分析圖像，使用“Granularity”模塊和“Find Fibers”模塊識(shí)別圓形顆粒和細(xì)長(zhǎng)的線粒體（圖 1）。
圖1 線粒體形狀的表型分析。
Molecular Devices高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)適用于各種細(xì)胞模型中化合物的藥物開發(fā)或毒性評(píng)估。不同化合物處理會(huì)導(dǎo)致線粒體形態(tài)變化，膜電位的損失、以及細(xì)胞的程序性死亡等。MetaXpress軟件非常適合進(jìn)行線粒體形態(tài)的測(cè)定，可以定義每個(gè)對(duì)象的數(shù)量、面積、強(qiáng)度、長(zhǎng)度和形狀（表1，2）。使用具有共聚焦模式的40X 水鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像，MetaXpress 自定義模塊編輯器分析圖像（圖 2）。這些檢測(cè)結(jié)果可以計(jì)算劑量反應(yīng)和各種化合物的有效濃度，以及用數(shù)字來(lái)表征線粒體結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)（圖 3）。
圖 2 化合物對(duì)線粒體的作用。使用MitoTracker Orange對(duì)線粒體進(jìn)行染色（ 黃色 ），對(duì)照組（A）、纈霉素（B）、魚藤酮（C）。
使用特定濃度的化合物（氯喹，魚藤酮和纈氨霉素）處理 PC12 細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色和成像。通過(guò)圖像分析將線粒體結(jié)構(gòu)確定為“纖維”(頂部) 或“顆粒”(中部)，底部為線粒體染色后熒光強(qiáng)度的變化。EC50的值取決于四個(gè)濃度依賴性復(fù)本和參數(shù)曲線的擬合（圖 3）。
圖 3使用氯喹（綠色），魚藤酮（紅色）和纈氨霉素（藍(lán)色）處理 PC12 細(xì)胞。EC50的值取決于四個(gè)濃度依賴性復(fù)本和參數(shù)曲線的擬合。
在分析過(guò)程中，我們比較了水鏡和空氣鏡對(duì)圖像質(zhì)量和分析的影響。結(jié)果顯示，使用水鏡可以提高圖像質(zhì)量，并且通常會(huì)導(dǎo)致 Z' 值增加（ 表 3 ）。圖4顯示了使用自定義模塊編輯對(duì)線粒體表型進(jìn)行計(jì)數(shù)和分析，以評(píng)估線粒體的健康、代謝、循環(huán)、復(fù)合效應(yīng)和疾病狀態(tài)等。并且，自定義模塊編輯可以針對(duì)特定的細(xì)胞類型或疾病模型進(jìn)行進(jìn)一步的調(diào)整和修改。
表1 用圖3所示的曲線定量 EC50
表 2 不同的對(duì)照和化合物處理方法的比較。上面四列數(shù)據(jù)分別是對(duì)照，10 um 的氯喹，300 nm的魚藤酮，和10 nm的纈氨酸霉素。
表 3 與空氣鏡相比，水鏡可以提高圖像質(zhì)量，獲得更高的Z’值。
總結(jié)：
Molecular Devices高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)適用于各種細(xì)胞模型中化合物的藥物開發(fā)或毒性評(píng)估。使用高內(nèi)涵成像和高級(jí)圖像分析的線粒體動(dòng)力學(xué)分析方法不僅可以量化線粒體的表型變化，而且這種多參數(shù)方法也可用于研究正常和病理結(jié)構(gòu)變化以表征疾病模型或復(fù)合效應(yīng)。
主要特點(diǎn)：
• 獲得高質(zhì)量的圖像，更好地顯示線粒體形狀和結(jié)構(gòu)的變化
• 以更有效、更精確的方式量化和測(cè)量線粒體的表型變化
• 了解疾病的機(jī)制并評(píng)估各種細(xì)胞模型中的化合物毒性