【方法解讀】DNA甲基化的檢測方法

時間：2023-3-22 閱讀：418

一、DNA甲基化概述
表觀遺傳學(xué)是研究DNA序列不發(fā)生改變的前提下，基因的表達發(fā)生可遺傳變化的一門學(xué)科。表觀遺傳修飾的研究內(nèi)容包含DNA甲基化、組蛋白甲基化、組蛋白乙?；?、ADP-核糖基化等。DNA甲基化是人類最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳修飾之一，屬于非組蛋白表觀遺傳現(xiàn)象。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA Methyltransferase, DNMTs）的催化下，將一個甲基（CH3）基團共價連接到胞嘧啶的5號碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）的過程。哺乳動物體細胞的DNA甲基化主要發(fā)生在CpG島（CpG islands，C指胞嘧啶，G指鳥嘌呤，p指連接CG堿基的磷酸）。研究結(jié)果表明，基因調(diào)控元件（如啟動子）的CpG島發(fā)生5mC修飾會在空間上阻礙轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物與DNA的結(jié)合。因而DNA甲基化一般與基因沉默相關(guān)，非甲基化一般與基因的活化相關(guān)，而去甲基化一般與沉默基因的重新激活相關(guān)。
細胞的表觀遺傳修飾與細胞代謝、癌癥、衰老、心血管疾病及神經(jīng)退行性疾病等多種疾病相關(guān)。受環(huán)境，疾病，性別和年齡等因素影響，DNA甲基化水平處于動態(tài)的變化過程。不同個體、組織與細胞之間，甚至是同一個體或細胞的不同發(fā)育時期，DNA甲基化的程度和狀態(tài)都可能存在差異。研究表明，DNA甲基化在基因調(diào)控、蛋白質(zhì)表達、胚胎發(fā)育、細胞分化、X染色體失活以及疾病和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。

二、DNA甲基化的常見檢測方法
DNA甲基化具有重要的生物學(xué)功能，科學(xué)家們開發(fā)了大量的方法檢測DNA甲基化水平。
目前常見的DNA甲基化測定方法包括以下幾類：
1. 基因組甲基化水平的分析方法：包括高效液相色譜（HPLC）和高效毛細管電泳法（HPCE）。
2. 候選基因甲基化分析方法：包括甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶-PCR/Southern法（MSRE-PCR/Southern）、重亞硫酸鹽測序法（Bisulphite Sequencing）、甲基化特異性的PCR（MS-PCR）、甲基化熒光法、焦磷酸測序（Pyrosequencing）、以及結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法（COBRA）等。
3. 基因組范圍的DNA甲基化模式與甲基化譜方法：包括限制性標記基因組掃描（RLGS）、甲基化間區(qū)位點擴增（AIMS）、甲基化CpG 島擴增（MCA）、差異甲基化雜交（DMH）、由連接子介導(dǎo)PCR出的HpaII小片段富集分析、以及甲基化DNA免疫沉淀法等。

三、使用微孔板讀板機測定DNA甲基化
1. DNA甲基化檢測
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化甲基基團共價連接到胞嘧啶的5號碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC），5mC是最早被發(fā)現(xiàn)，也是研究最多的修飾堿基，在基因表達調(diào)控、生物生長發(fā)育和疾病發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用。5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）是在哺乳動物胚胎干細胞和人、小鼠腦細胞中表達的一種修飾，它可以把胞嘧啶羥甲基化。DNA 甲基化水平是一個DNA 甲基化和DNA 去甲基化的動態(tài)調(diào)控的過程。研究結(jié)果表明，5mC可以導(dǎo)致基因沉默或基因表達水平降低，而5hmC作為去甲基化過程的第一步，會導(dǎo)致基因激活或基因表達水平升高。分析5mC和5hmC在不同細胞和基因組不同區(qū)域的含量和比例，對于確認健康和疾病的細胞/組織中的甲基化修飾變化具有重要意義。高效液相色譜法（HPLC）, 薄層色譜法（TLC）和質(zhì)譜等基于層析的技術(shù)都可以被用來檢測5mC和5hmC，但是它們步驟復(fù)雜，耗時，且成本較高。

利用微孔板讀板機（酶標儀）進行DNA甲基化相關(guān)實驗測定靈敏度高，特異性好，并且整個操作步驟簡易，快速。可以利用Molecular Devices酶標儀，結(jié)合DNA甲基化檢測分析試劑盒，通過光吸收法或熒光法定量檢測不同樣本的甲基化DNA（5mC）和羥甲基化DNA（5hmC）。

2. DNA甲基轉(zhuǎn)移酶檢測
DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要部分，DNA甲基化模式的改變會導(dǎo)致腫瘤及多種疾病的發(fā)生，例如在很多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的表達異常。對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的研究不僅可以揭示DNA甲基化對基因表達調(diào)控的機制，對腫瘤等疾病的治療也具有潛在意義。

作為甲硫氨酸的活性形式，s-腺苷甲硫氨酸（s-adenosyl-methionine，SAM）在生物體內(nèi)的各種代謝過程中起重要作用，參與催化人體內(nèi)多種不同甲基轉(zhuǎn)移酶，并且與多種甲基轉(zhuǎn)移酶的活性密切相關(guān)。SAM作為甲基供體，在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，可以將甲基基團轉(zhuǎn)移到相應(yīng)底物上，隨后生成s-腺苷高半胱氨酸（s-adenosyl-l-homocysteine，SAH）。甲基轉(zhuǎn)移酶通用酶活評價分析方法就是利用這一特性，通過檢測SAH的含量變化，從而評估催發(fā)反應(yīng)中甲基轉(zhuǎn)移酶的活力和反應(yīng)效率等。
Elisa作為傳統(tǒng)的方法，存在實驗步驟多，需要經(jīng)過多次洗板、加樣、顯色等操作步驟，耗時長，結(jié)果不穩(wěn)定等不足?？梢岳?span style="font-family: "times new roman" , serif;">Molecular Devices酶標儀，結(jié)合均相時間分辨熒光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence，HTRF）的方法檢測甲基轉(zhuǎn)移酶，這種檢測方法適合幾乎所有甲基轉(zhuǎn)移酶和底物的檢測，操作步驟簡單、靈敏度高且無放射性污染。