基于細(xì)胞涂色檢驗的表型分析的簡化工作流程

Angeline Lim, Misha Bashkurov | Molecular Devices LLC

David Egan, Victor Wong | Core Life Analytics

簡介

細(xì)胞涂色檢驗（cell painting assay）等多參數(shù)高內(nèi)涵篩選方法越來越多的被應(yīng)用到從藥物研發(fā)到功能基因組學(xué)篩選等領(lǐng)域。細(xì)胞涂色檢驗用到多達(dá)6種熒光染料在單細(xì)胞水平來標(biāo)記及觀察各種細(xì)胞器。分析中獲得的所有特點都能賦予指定的細(xì)胞的細(xì)胞表征。另外，通過對比新型化合物和參比化合物的表型特征能了解到作用機制。大多數(shù)生物學(xué)家都熟悉細(xì)胞涂色檢驗所用的方法。然而，要想在海量的實驗數(shù)據(jù)中獲得有意義的信息還需要計算工具的輔助。

在此，我們介紹了一種易于完成的細(xì)胞涂色檢驗的完整流程。通過這一方法，我們發(fā)現(xiàn)用同一種化合物處理的細(xì)胞表現(xiàn)出相同的表性特征。分層聚類分析能將紫杉醇和魚藤酮之類的高毒性化合物分到同一組。氯喹和粉防己堿這兩種影響自噬的化合物同樣被分到同一組里。這些結(jié)果表明此處提出的工作流程是開展高內(nèi)涵表型分析可行且可靠的方法。

方法

基于圖像的分析工作流程概述。以下列出了每個步驟的詳細(xì)信息。

1、U2OS細(xì)胞（ATCC）按每孔2000個細(xì)胞接種。

2、總共測試了11中化合物，每種化合物按照1:3梯度稀釋（共7個濃度），每個濃度4個復(fù)孔，同時加入合適的對照。化合物如下：Ca-074-Me，羰基氰化物間氯苯腙（CCCP），氯喹（chloroquine），細(xì)胞松弛素D（cytochalasin D），依托泊苷（etoposide），拉氏菌素B（latrunculin B），雷帕霉素（rapamycin），魚藤酮（rotenone），十字孢堿（staurosporine），紫杉醇（paclitaxel）和粉防己堿（tetrandrine）。

3、化合物處理24小時后，根據(jù)Bray等人的實驗方案用細(xì)胞涂色染料對細(xì)胞進(jìn)行染色。包括以下染料：MitoTracker Deep Red，wheat-germ agglutinin/Alexa Fluor 555，Concanavalin A/Alexa Fluor 488，phalloidin/Alexa Fluor 568，SYTO14和Hoechst 33342。

4、用美谷分子儀器的ImageXpress®顯微共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)（ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System（Molecular Devices））進(jìn)行圖像采集，物鏡為20× Plan Apo objective，激發(fā)/發(fā)射濾光片如下：DAPI 377/447，FITC 475/536，TRITC 543/593，Texas Red 560/624，Cy5 631/692。

5、用IN CartaTM圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。選擇的280個測量值包括跟強度、紋理、形狀、空間關(guān)系及共定位評分相關(guān)的參數(shù)。

6、細(xì)胞級數(shù)據(jù)已上傳至StratoMineRTM進(jìn)行進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析。簡言之就是實施了質(zhì)量控制、微孔板正規(guī)化、數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換以及特征標(biāo)準(zhǔn)化。用主成分分析（principal component analysis，PCA）降低數(shù)據(jù)集的維度。進(jìn)一步的下游分析，例如命中選擇及聚類分析，則基于主成分和推導(dǎo)的表型距離評分。

結(jié)果

血管生成建模

在我們的模型檢測中，U2OS細(xì)胞用11種化合物處理24小時，之后按照以前發(fā)表的實驗方案處理。用ImageXpress顯微共聚焦系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞成像（圖1）。

圖1. 細(xì)胞涂色檢驗。細(xì)胞經(jīng)化合物處理，染色然后成像。對照孔各個采集通道的成像示例。最后一個圖片展示了肌動蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核的復(fù)合圖像。

特征提取

使用IN Carta軟件，可調(diào)整圖像分析程序以實現(xiàn)細(xì)胞及細(xì)胞器的可靠檢測（圖2）。深度學(xué)習(xí)語義分割模塊（SINAP）可以用來提升挑戰(zhàn)性特征的檢測。預(yù)訓(xùn)練的深度學(xué)習(xí)模型可用來檢測細(xì)胞核或細(xì)胞。或者，用戶也可以根據(jù)自己感興趣的特定對象來訓(xùn)練新的模型。

圖2. IN Carta軟件中的特征提取。A）在IN Carta軟件中建立分析實驗方案來分割各個細(xì)胞結(jié)構(gòu)。此處我們用內(nèi)置的細(xì)胞核模型實現(xiàn)了所有處理的細(xì)胞核的有效分割。其他細(xì)胞特征包括細(xì)胞質(zhì)區(qū)域、肌動蛋白絲網(wǎng)絡(luò)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體也得到了分割。在設(shè)定分析時選擇了跟強度、紋理、共定位和形狀相關(guān)的測量值。在實驗方案中我們共選擇了細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的280個測量值。B）IN Carta軟件中帶有特征掩飾疊加的圖像示例。

數(shù)據(jù)分析工作流程

將IN Carta軟件中獲得的測量值上傳至HC StratoMineR進(jìn)行進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析（圖3）。

圖3A-B. 利用HC StratoMineR進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。A）HC StratoMineR是一個基于網(wǎng)絡(luò)的平臺，能通過典型的工作流程指導(dǎo)用戶進(jìn)行高內(nèi)涵多參數(shù)數(shù)據(jù)分析。B）QC步驟的散點圖。X軸代表了所有樣本，Y軸代表了選中的特征（細(xì)胞核區(qū)域）。

圖3C-D. 利用HC StratoMineR進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。C）主成分分析（廣義加權(quán)最小二乘法）將數(shù)據(jù)減低至15個成分。對PCA4的特征貢獻(xiàn)以極坐標(biāo)圖顯示。D）3D散點圖顯示了數(shù)據(jù)點與3種不同PCA之間的互作。

表型特征比較-聚類

距離分?jǐn)?shù)根據(jù)選定的主成分分?jǐn)?shù)進(jìn)行計算。這一分?jǐn)?shù)代表了樣本與陰性對照之間的表型距離，能用于篩選分析中的命中選擇。隨后，可基于選中的特征或成分進(jìn)行分層聚類分析。

用同一種化合物處理的細(xì)胞聚類到一起（圖4A，簇9,10）。已知具有相似細(xì)胞效應(yīng)的化合物也聚類到一起。肌動蛋白聚合抑制劑細(xì)胞松弛素D和拉氏菌素B共同存在于簇6中。在自噬信號通路中有作用的粉防己堿和氯喹也聚類到一起（圖4B）。

圖4. 聚類分析。A）樹狀圖代表了分層關(guān)系。屬于相同簇的孔（編號）用彩條表示。每個孔基于距離分?jǐn)?shù)的p值展示了出來。注意，簇9僅由十字孢堿處理的細(xì)胞組成，而簇10僅由依托泊苷處理的細(xì)胞組成。B）屬于某些簇的化合物處理的細(xì)胞示例。簇5由粉防己堿和氯喹處理的細(xì)胞組成。兩者處理的孔中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)點都有增加。簇4由魚藤酮和紫杉醇處理的細(xì)胞組成，這些孔中的部分細(xì)胞有起泡出現(xiàn)。表明了細(xì)胞毒性作用。

基于表型特征的劑量-反應(yīng)建模

圖5. 劑量-反應(yīng)曲線。使用從命中選擇步驟獲得的表型距離分?jǐn)?shù)繪制IC StratoMineR中每一種化合物劑量反應(yīng)曲線。Y軸代表了表型距離，X軸代表濃度。

結(jié)論

我們的結(jié)果表明利用ImageXpress顯微共聚焦系統(tǒng)、IN Carta軟件和StratoMineR實現(xiàn)基于圖像的分析的可行性。

IN Carta軟件結(jié)合了易用性及更高級的特征分割選項（SINAP），可實現(xiàn)細(xì)胞特征的可靠分割。

StratoMineR平臺允許非專家用戶根據(jù)直觀的引導(dǎo)式工作流程進(jìn)行快速的表型數(shù)據(jù)分析。

參考文獻(xiàn)

1.       Bray MA et.al., Nat Protoc. 2016 Sep;11(9):1757–74.

2.       Gong K et.al., J Biol Chem. 2012 Oct 12;287(42):35576–88.

3.       Gustafsdottir SM et.al., PLoS One. 2013 Dec 2;8(12):e80999.

4.       Mauthe M, et.al., Autophagy. 2018;14(8):1435–1455.

5.       Omta WA, et.al., Assay Drug Dev Technol. 2016 Oct;14(8):439–452.

6.       Rohban MH, et.al., Elife. 2017 Mar 18;6:e24060.