簡(jiǎn)介

開(kāi)發(fā)更復(fù)雜的、生物相關(guān)的、預(yù)測(cè)性的基于細(xì)胞的化合物篩選分析是藥物發(fā)現(xiàn)的主要挑戰(zhàn)之一。人們對(duì)使用三維(3D)培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)開(kāi)發(fā)和轉(zhuǎn)錄生物學(xué)越來(lái)越感興趣。3D培養(yǎng)被認(rèn)為具有密切概括人體組織方面的優(yōu)勢(shì)，包括結(jié)構(gòu)，細(xì)胞組織，細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，以及更多生理相關(guān)的擴(kuò)散特征。水凝膠被廣泛用作人工細(xì)胞外基質(zhì)，用于在三維環(huán)境中培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞。完全合成的水凝膠被預(yù)先澆鑄在96孔板上，具有深度表面密度梯度，促進(jìn)沉積在水凝膠表面的細(xì)胞在3D中的滲透(3DProSeedTM水凝膠)。該平臺(tái)具有高度的易用性和高度的自動(dòng)化兼容性。

人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)來(lái)源的神經(jīng)元越來(lái)越多地用于生理細(xì)胞模型的開(kāi)發(fā);與原代細(xì)胞和動(dòng)物模型相比，它們的人類起源、長(zhǎng)期的培養(yǎng)活力和高容量的可用性使它們?cè)谏窠?jīng)科學(xué)應(yīng)用方面相對(duì)于初代細(xì)胞和動(dòng)物模型更具優(yōu)勢(shì)。

目的

本研究的重點(diǎn)是利用ipsc來(lái)源的神經(jīng)元在水凝膠基質(zhì)中發(fā)育，開(kāi)發(fā)一種高通量3D神經(jīng)突生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，其長(zhǎng)期目標(biāo)是建立兼容自動(dòng)化的神經(jīng)退行性和神經(jīng)毒理學(xué)篩選3D模型。

方法

ImageXpress® Micro Confocal 共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)

配有寬場(chǎng)和共聚焦(60μm 針孔)光路

MetaXpress® High-Content 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件

實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)

用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞是CNS.4UTM (Ncardia)，這是一種iPSC來(lái)源的細(xì)胞混合物，由神經(jīng)元(谷氨酸能、多巴胺能和GABA能)以及星形膠質(zhì)細(xì)胞組成。

Ectica Technologies提供的3DProSeedTM 96孔板。該孔板含有預(yù)先澆鑄的全合成聚乙二醇基水凝膠。水凝膠具有較深的表面密度梯度，促進(jìn)神經(jīng)突的三維浸潤(rùn)和三維網(wǎng)絡(luò)的建立。該水凝膠平臺(tái)使用簡(jiǎn)單，自動(dòng)化兼容性高(Simona et al. 和 Zhang et al.)。

水凝膠3D神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成

CNS.4U細(xì)胞在3DProSeed水凝膠中培養(yǎng)14天。細(xì)胞在200 μL培養(yǎng)液中以40000個(gè)神經(jīng)元/孔接種。接種密度可以改變。培養(yǎng)基組成為50:50的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ DMEM/F12 +補(bǔ)充劑(Ncardia)

細(xì)胞首先沉淀在水凝膠表面，然后滲透到水凝膠內(nèi)部。神經(jīng)突在移植后約24小時(shí)開(kāi)始形成，在培養(yǎng)過(guò)程中延長(zhǎng)至14天。隨著時(shí)間的推移，神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)的形成使用透射光和共聚焦成像進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

染色

終點(diǎn)測(cè)量用4%的甲醛固定細(xì)胞，然后用0.01%的Triton X-100滲透，用針對(duì)TuJ-1神經(jīng)元標(biāo)記的熒光基團(tuán)偶聯(lián)抗體和Hoechst核染料進(jìn)行染色。

參考文獻(xiàn)

1. Simona B.R. et al., Biomater. Sci., 3:586-591, 2015.

2. Zhang N. & Milleret V., SLAS Discovery, accepted, 2017.

3. Sirenko et al., Assay and Drug Dev Technologies12(9-10):536-47

結(jié)果：3D培養(yǎng)物的表型分析

成像

采用高內(nèi)涵成像和分析技術(shù)對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行評(píng)價(jià)。我們優(yōu)化了細(xì)胞培養(yǎng)和染色，并開(kāi)發(fā)了共聚焦成像和分析方案，用于評(píng)估神經(jīng)元在3D基質(zhì)中的形態(tài)和活力。使用ImageXpress® Micro Confocal共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)和10X或4X物鏡，沿對(duì)焦軸(Z-stack)在不同平面上獲取一系列圖像。獲得了11-33個(gè)平面堆棧，間距為5-10 μm，覆蓋深度約為100-300 μm。保存所有單獨(dú)的圖像并用于3D分析，以及2D投影(最大投影或Best Focus)圖像。

共聚焦圖像，Z-stack, 30 μm 間距

圖1. 將CNS.4U細(xì)胞接種于3DProSeed，在共聚焦模式下成像14天。細(xì)胞核用Hoechst染色(紅色)以及TuJ -1微管蛋白染色(綠色)。四個(gè)平面代表凝膠中的不同焦平面。神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)延伸到水凝膠中幾百微米。

圖像分析

自動(dòng)定量分析采用2種方法:投影圖像分析(2D)或3D分析。使用神經(jīng)突生長(zhǎng)算法分析2D最大投影圖像。表型讀數(shù)包括通過(guò)多種讀數(shù)來(lái)定量表征神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的范圍和復(fù)雜性，包括測(cè)量神經(jīng)突的生長(zhǎng)，主干和分支的數(shù)量，以及細(xì)胞數(shù)量和活力。投影圖像的分析速度更快，并且可以很好地定量。

圖2. 將CNS.4U細(xì)胞以不同的播種密度(5000 - 80000個(gè)細(xì)胞/凝膠)接種在3DProSeed上。細(xì)胞培養(yǎng)14天，使用ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)成像。3D成像(Z-stacking)，并使用最大投影進(jìn)行分析。分析允許自動(dòng)測(cè)量細(xì)胞數(shù)量，神經(jīng)突生長(zhǎng)(神經(jīng)突長(zhǎng)度)，以及主干和分支的數(shù)量。上層平面表示透射光投影圖像和用于神經(jīng)元檢測(cè)的疊加分析掩模。圖表顯示了各種測(cè)量結(jié)果與孔板神經(jīng)元數(shù)量的相關(guān)性。三個(gè)復(fù)孔的平均值。

3D可視化和3D圖像分析

分析軟件允許組合來(lái)自不同平面的對(duì)象以及細(xì)胞和網(wǎng)絡(luò)的3D可視化。自定義模塊用于定義“纖維”的生長(zhǎng)和細(xì)胞核。首先在每個(gè)平面中找到對(duì)象，然后使用“connect by best match”功能在3D空間中連接。3D分析通常需要更長(zhǎng)的時(shí)間，但可以對(duì)體積中的物體(包括重疊的物體)進(jìn)行更好的分辨和定量分析。

圖3. 左圖:MetaXpress軟件對(duì)水凝膠中細(xì)胞和網(wǎng)絡(luò)的3D可視化。3D可視化顯示細(xì)胞核(假色)、TuJ-1陽(yáng)性的神經(jīng)突和細(xì)胞體(紅色)。中圖:在單個(gè)平面中定義的“纖維”的分析掩膜。通過(guò)3D分析確定每孔纖維(神經(jīng)突)的數(shù)量、纖維(神經(jīng)突)的總體積、分支點(diǎn)的數(shù)量和細(xì)胞(細(xì)胞核)的數(shù)量。圖表顯示了測(cè)量結(jié)果與孔板神經(jīng)元數(shù)量(三次重復(fù))的相關(guān)性。

3D水凝膠神經(jīng)毒性實(shí)驗(yàn)

表型讀數(shù)包括通過(guò)多種讀數(shù)定量表征神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的范圍和復(fù)雜性。我們?cè)u(píng)估了測(cè)定的可重復(fù)性，描述了多次測(cè)量，并測(cè)試了一系列已知的神經(jīng)毒物化合物。比較了兩種分析方法:使用標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)突生長(zhǎng)算法分析投影圖像和使用定義纖維、分支和細(xì)胞核的自定義模塊進(jìn)行3D分析。

圖4. 在接種后72h，將三種已知具有神經(jīng)毒性作用的化合物以不同的濃度添加到神經(jīng)元培養(yǎng)物中，濃度范圍為0 ~ 10 μM。

上圖:化合物對(duì)神經(jīng)元發(fā)育的抑制作用。如上所述對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色和成像。

上圖:使用2D壓縮圖像(最大投影)進(jìn)行分析。測(cè)定神經(jīng)突生長(zhǎng)、細(xì)胞數(shù)、主干和分支數(shù)。神經(jīng)突生長(zhǎng)的濃度-響應(yīng)曲線顯示:甲基汞(紅色，IC50 5nM)，狄氏劑(藍(lán)色，IC50 170nM)和魚(yú)藤酮(綠色，IC50 220nM)。IC50值與3D分析相當(dāng)(下圖)，使用標(biāo)準(zhǔn)2D神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)獲得結(jié)果(Sirenko等)。

下圖:3D分析結(jié)果。測(cè)量神經(jīng)突(纖維)數(shù)量、纖維(神經(jīng)突)體積、分支點(diǎn)和總細(xì)胞數(shù)。神經(jīng)突總體積(μm3)的濃度響應(yīng)曲線:甲基汞(紅色，IC50 2nM)，狄氏劑(藍(lán)色，IC50 170nM)，魚(yú)藤酮(綠色，IC50 750nM)。

總結(jié)

利用3DProSeedTM水凝膠對(duì)iPSC來(lái)源的CNS.4UTM神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行3D培養(yǎng)和共聚焦高內(nèi)涵成像，我們開(kāi)發(fā)了一種定量高通量分析方法，可以評(píng)估3D神經(jīng)元培養(yǎng)物的活力和形態(tài)變化。

更高的分辨率和多參數(shù)分析允許神經(jīng)突和單細(xì)胞計(jì)數(shù)，并在3D中統(tǒng)計(jì)表征神經(jīng)突的發(fā)育和分支。2D和3D分析能夠表征神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，并提供定量測(cè)量，可用于定義IC50值并比較各種化合物的毒性。