簡(jiǎn)介
單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (scRNA-seq) 是一種用于對(duì)復(fù)雜細(xì)胞 和組織樣本中的基因表達(dá)進(jìn)行無偏差表征的技術(shù)。盡管 scRNA-seq chedi改變了現(xiàn)代生物學(xué)，但在技術(shù)上仍然具 有挑戰(zhàn)性，并且通常成本高昂。目前市場(chǎng)上的解決方案能夠在擁有數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的初始池時(shí)對(duì)一小部分細(xì)胞進(jìn)行有效分析。然而，處理稀有細(xì)胞群的 scRNA-seq 文庫(kù)制備 的簡(jiǎn)化方案仍然缺失。 在這里，我們開發(fā)了一種新型孔板檢測(cè)法，用于性價(jià)比 高且高度 敏 感的 scRNA-seq。該工作流 程 支 持 來自稀 有細(xì)胞群的稀有樣本文庫(kù)制備。在此新工作流程中 ( 圖 1 )，我 們 使 用 了 DispenCell 和專用檢測(cè)吸頭 ( SEED Biosciences，瑞士 )，與專用和優(yōu)化的單細(xì)胞文庫(kù)制備系統(tǒng) ( MERCURIUS 高靈敏度 BRB-seq 試劑盒，Alithea Genomics，瑞士 )。
單細(xì)胞分配
首先，在測(cè)序文庫(kù)制備之前，我們測(cè)試了 DispenCell 在專用裂解緩沖液中分配單細(xì)胞的能力。淋巴細(xì)胞系從冷凍的小瓶中解凍，傳代兩次，然后在單細(xì)胞懸浮液中收 獲。使 用 10 μm 細(xì)胞過濾器 ( Miltenyi Biotec，德 國(guó) ) 過濾細(xì)胞，計(jì)數(shù)并在無 RNAse 的甲基纖維素分配溶液 (DispenMe、SEED Biosciences) 中 稀 釋 至 最 終 濃 度 為 2×104 cells/mL。 然 后，使 用 DispenCell 傳感吸頭從細(xì)胞懸浮液中裝載 200 個(gè) 細(xì) 胞。設(shè) 置 DispenCell 將單細(xì) 胞分配 到 384 孔 板，孔板預(yù)裝 4.2 μL 裂解緩沖液 ( HS BRB seq 試劑盒， Alithea Genomics )。前 96 個(gè)孔 分 配 大 約 7 分鐘。然 后，停止分配，因?yàn)槲覀冇凶銐虻臉悠愤M(jìn)行下游分析。
單細(xì)胞質(zhì)量控制
分配后，我們立即使用 SEED Biosciences 開發(fā)的軟件 DispenSoft 進(jìn)行單細(xì)胞質(zhì)量控制后處理?？装宓拿總€(gè)孔 用顏色編碼的矩陣表示 ( 圖 2.a)。 當(dāng)孔中含有單個(gè)細(xì)胞時(shí)，軟件將其標(biāo)記為綠色，而紅色 孔中則含有零個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，應(yīng)丟棄。為了區(qū)分碎片和細(xì) 胞，通過對(duì)基于大小的直方圖進(jìn)行門控來設(shè)置閾值 ( 圖 2.b )。只有高于閾值的峰才算作細(xì)胞。
在這里，我們獲得了 77 個(gè)單細(xì)胞孔 ( 80% 單細(xì)胞分離 率 )。使用 DispenSoft，原始阻抗數(shù)據(jù)也可用于記錄過程?？墒謩?dòng)檢查每個(gè)阻抗曲線。單尖峰是單細(xì)胞的特征 ( 圖 2.c ) 而多個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生多個(gè)峰。這表明 DispenCell 能 夠以簡(jiǎn)單、快速和wanquan可追溯的過程在裂解緩沖液中分 配單細(xì)胞。