收到細(xì)胞后，請按照以下方法進(jìn)行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時或者過夜，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2. 待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3. 細(xì)胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養(yǎng)液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代，然后補充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4) 待細(xì)胞*貼壁后，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基。

產(chǎn)品名稱

名稱    胰腺癌組織源細(xì)胞

2.組織來源：胰腺癌組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶

4.細(xì)胞簡介：

人胰腺癌組織源細(xì)胞分離自患有胰腺癌病人的胰腺癌組織；胰腺癌是一種惡性程度很高，診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，約90%為起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌。其發(fā)病率和死亡率近年來明顯上升。5年生存率<1%，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。胰腺癌早期的確診率不高，手術(shù)死亡率較高，而很低。胰腺癌的病因尚不十分清楚。其發(fā)生與吸煙、飲酒、高脂肪和高蛋白飲食、過量飲用咖啡、環(huán)境污染及遺傳因素有關(guān)；近年來的調(diào)查報告發(fā)現(xiàn)糖尿病人群中胰腺癌的發(fā)病率明顯高于普通人群；也有人注意到慢性胰腺炎病人與胰腺癌的發(fā)病存在一定關(guān)系，發(fā)現(xiàn)慢性胰腺炎病人發(fā)生胰腺癌的比例明顯增高；另外還有許多因素與此病的發(fā)生有一定關(guān)系，如職業(yè)、環(huán)境、地理等。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，大部分癌癥的生存率都在提高，例如乳腺癌，結(jié)直腸癌等腫瘤，近幾十年來，生存率得到了大幅度的提升。但胰腺癌的生存率一直停滯不前，缺乏有效的治療方法，*的死亡率使其成為，體外培養(yǎng)胰腺癌組織源細(xì)胞對研究胰腺癌的治療具有重要意義。

5.方法簡介：

實驗室分離的癌組織源細(xì)胞采用膠原酶消化、經(jīng)Percoll離心純化制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

6.質(zhì)量檢測：

實驗室分離的人胰腺癌組織源細(xì)胞經(jīng)檢測，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

7.培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

產(chǎn)品貨號CM-H153

換液頻率每2-3天換液一次

生長特性貼壁

細(xì)胞形態(tài)梭形、多角形

傳代特性可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)最佳

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣，95%；CO2，5%

產(chǎn)品特點:

1、 使用方便:不需昂貴設(shè)備。

2、 可以處理各種細(xì)菌菌體，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時。

4、 采用溫和的中性裂解組分，保持蛋白活性。

5、 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

6、 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等。

8、 本試劑盒中不有EDTA，與金屬螯和層析等兼容。

細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

一、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前，應(yīng)觀察細(xì)胞生長是否良好(log phase) 且存活率高，凍存的細(xì)胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細(xì)胞是否保有其*性質(zhì)，例如是否有雜細(xì)胞或者支原體等。

3. 使用的DMSO 應(yīng)為試劑級等級，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存，勿作多次解凍。使用的甘油也應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性。

4. 冷凍保存的細(xì)胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細(xì)胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細(xì)胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后。

4-3.貼壁腫瘤細(xì)胞: 1 x 10^6，依細(xì)胞種類而異。腺癌類的細(xì)胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml。

4-4. 懸浮細(xì)胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細(xì)胞須至少5 x 10^6 cells/ml。

5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應(yīng)作一個backup culture，以防止冷凍失敗。