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細(xì)胞培養(yǎng)時消化液的配制
閱讀：345 發(fā)布時間：2017-6-27| 提 供 商 | 上海谷研實業(yè)有限公司 | 資料大小 | 28.9KB |
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經(jīng)常使用的是胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液，傳代時用以使細(xì)胞脫離附著底物表面和離散成單個細(xì)胞。它們可以單獨使用，也可按一定比例混合一起使用，這主要根據(jù)細(xì)胞的要求，可自行試驗以做取舍。從經(jīng)濟(jì)和使用方便考慮，因EDTA易獲得和易配制，可以選擇作為常用的消化液。
1．胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶主要采自牛或豬的胰臟，是一種黃白色粉末，易潮解，應(yīng)放置冷暗干燥處保存。主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞相互離散。胰蛋白酶的活力是用解離酪蛋白的能力表示的，經(jīng)常使用的有 1：125 和 1：250 的兩種濃度，即1份胰蛋白酶能分別解離125份或250份酪蛋白。胰蛋白酶對細(xì)胞的分離作用與細(xì)胞的類型和細(xì)胞的特性有密切關(guān)系。不同的細(xì)胞系對胰蛋白酶溶液的濃度、溫度和作用時間等的要求也不一樣。一般來講，濃度大、溫度高、作用時間越長，對細(xì)胞分離能力也越大，但超過一定的限度也會損傷細(xì)胞。胰蛋白酶溶液在 pH 8．0，溫度為37℃時，作用能力zui強。此外，許多學(xué)者認(rèn)為，Ca2+ 、Mg2+ 和血清中蛋白質(zhì)的存在會降低其活力。所以常用無 Ca2+ 、Mg2+ 的溶液配制。消化細(xì)胞時，加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液，或胰蛋白酶抑制劑能終止胰蛋白酶對細(xì)胞的繼續(xù)作用。
在國外的的目錄中．除我們常用的較為粗制的混合型胰蛋白酶外，還有從中提取純化的各種亞型的精制胰蛋白酶產(chǎn)品，它們對某種特定組織解離作用較強，可以用于特殊需要．但價格較為昂貴。胰蛋白酶溶液的配制方法如下。
(1)將D-Hartks 液或 Duldecco 鹽溶液高壓消毒滅菌，用 NaHCO3 液調(diào)節(jié)pH至 7.2 左右。
(2)稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，先用少許消毒的鹽溶液調(diào)成糊狀，然后再補足鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4h或冰箱內(nèi)過夜，并不時攪拌振蕩。
(3)次日先用濾紙粗濾，再進(jìn)行過濾除菌，分裝入瓶中，低溫冰箱保存?zhèn)溆?，常用濃度?．25％或0．125％；胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可調(diào)pH至7.2左右。2．EDTA溶液：EDTA是一種化學(xué)螯合劑，其溶液又稱VerSen液，對細(xì)胞有一定的解離作用，并且毒性小，價格低廉，使用方便。使用濃度一般為0.02％，但某些個別細(xì)胞系要求濃度較高。用無鈣、鎂鹽溶液溶解后，高壓蒸氣滅菌，分裝成小瓶，室溫或4℃冰箱保存。
3．膠原酶溶液膠：原酶在上皮類組織原代培養(yǎng)時用于組織細(xì)胞的解離，作用的對象是膠原組織，不容易對細(xì)胞產(chǎn)生損傷。膠原酶的使用濃度為0．1～0 3mg~／L或200 000U／L，作用的*州為6．5。膠原酶不受Ca2+ 、Mg2+ 及血清的抑制，配制時可用 PBS。