實(shí)時(shí)熒光定量PCR：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性定量方法，已得到，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

操作流程
收集基因信息——>設(shè)計(jì)引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細(xì)胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實(shí)物保存。

下列相關(guān)產(chǎn)品：
脊髓灰質(zhì)炎病毒型PCR檢測試劑盒

寄生曲霉PCR檢測試劑盒

寄生水霉PCR檢測試劑盒

加利福利亞腦炎病毒PCR檢測試劑盒

PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl     dNTP mix （2mM）
4 μl     引物1（10pM）
2 μl     引物2（10pM）
2 μl     Taq酶 （2U/μl）
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl      加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2：調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，在72℃ 保7min。
3：伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4：PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

定量PCR方法：
a、競爭法　　產(chǎn)品僅用于科研實(shí)驗(yàn)
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

下列是公司正在銷售的產(chǎn)品：
4-Amino-N-methylbenzamide  6274-22-2  中文名：4-氨基-N-甲酰胺  分子式：C8H10N2O  度：98.0%      小鼠銅藍(lán)蛋白(CP/CER)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

4-Aminohippuric acid  61-78-9  中文名：4-氨基馬尿酸  分子式：C9H10N2O3  度：98.0%      小鼠p53(p53)ELISAKit   ELISA.   96T/48T           

4-Aminobutyric acid  1956/12/2  中文名：4-氨基丁酸  分子式：C4H9NO2  度：98.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠巨噬細(xì)胞游走抑制因子   英文名稱：   macrophage migration inhibitory factor   規(guī)格：   48T/96T   英文縮寫：   MIF

4-Aminobenzophenone  1137-41-3  中文名：4-氨基二苯甲酮  分子式：C13H11NO  度：99.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1   英文名稱：   Macrophage Inflammatory protein 1   規(guī)格：   48T/96T   英文縮寫：   MIP-1

4-Aminoantipyrine  1983/7/8  中文名：4-氨基林  分子式：C11H13N3O  度：99.0%  關(guān)鍵詞：    小鼠巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2   英文名稱：   Macrophage Inflammatory protein 2   規(guī)格：   48T/96T   英文縮寫：   MIP-2

1018946-38-7  DWK-1339 (MDR-1339)  5mg  Semen cassiae決明子染料法PCR鑒定試劑盒 

101896-80-4  LSM-775 (maleate) (solution)  100μg  Flos chrysanthemi菊花染料法PCR鑒定試劑盒 

101901-73-9  12-OAHSA  10mg  Herba schizonepetae荊芥染料法PCR鑒定試劑盒 

101901-73-9  12-OAHSA  1mg  Semen allii tuberosi韭菜子染料法PCR鑒定試劑盒 

101901-73-9  12-OAHSA  5mg  Semen allii tuberosi韭菜子染料法PCR鑒定試劑盒
酵母菌屬通用PCR檢測試劑盒168781-78-0  Ac-Ile-Tyr-Gly-Glu-Phe-NH2  25mg  Caulis perillae紫蘇梗探針法PCR鑒定試劑盒 

112514-60-0  (Fmoc-Cys-OSu)2  1g  Caulis perillae紫蘇梗探針法PCR鑒定試劑盒 

112514-60-0  (Fmoc-Cys-OSu)2  5g  Herba violae紫花地丁探針法PCR鑒定試劑盒 

1676104-79-2  H-Cys(NPys)-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-NH2  1mg  Herba violae紫花地丁探針法PCR鑒定試劑盒 

1676104-79-2  H-Cys(NPys)-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-NH2  5mg  Placenta hominis紫河車探針法PCR鑒定試劑盒