化工儀器網
詳細介紹
操作流程
收集基因信息——>設計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產物 ——> 用感受態(tài)細胞做轉化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質粒抽提——>質粒測序——>測序結果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質粒實物保存。
產品名稱 | 英文名稱 | 規(guī)格 |
指環(huán)蟲屬通用PCR檢測試劑盒 | Dactylogyrus spp.PCR | 50T |
PCR實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2：調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，在72℃ 保7min。
3：伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4：PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μl進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
下列相關產品：
嗜吞噬細胞無漿體PCR檢測試劑盒
嗜血桿菌通用PCR檢測試劑盒
嗜衣原體通用PCR檢測試劑盒
匙形古柏線蟲PCR檢測試劑盒
實時熒光定量PCR：
實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現(xiàn)性定量方法，已得到，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。
定量PCR方法：
a、競爭法
選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
b、內參照法
在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由于內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗di高辛酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。
下列是公司正在銷售的產品：
HLA-DR(human leukoyte Antigen DR) HLA-DR抗原Multi-class antibodies規(guī)格： 0.5mg
Anti-A2AR 腺苷A2A受體抗體Multi-class antibodies規(guī)格： 0.2ml
Rhesus antibody Rh phospho-CK II beta(Ser209) 0酸化絲/蛋白激酶II β(casein kinase IIβ)抗體 規(guī)格 0.1ml
羊抗人IgA血清 0.5ml 國產
WRB 英文名稱： 色酸豐富蛋白抗體 0.2ml
DAT 英文名稱： 多巴胺轉運蛋白DAT抗體 0.1ml
Anti-A2AR 腺苷A2A受體抗體Multi-class antibodies規(guī)格： 0.2ml
phospho-Stathmin 1 (Ser24)： 0酸化原癌基因蛋白18抗體 0.1ml
Eppin： 附睪抑制蛋白 0.2ml
腺苷酸環(huán)化酶激活肽-27/38抗體 Anti-PACAP-27/38 0.2ml
Anti-SP-D/FITC 熒光素標記肺表面活性蛋白D抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格： 0.2ml
Rhesus antibody Rh Phospho-NFKB1(Ser907) 0酸化細胞核因子p50/k基因結合核因子抗體 規(guī)格 0.1ml
ERAB 內質網Aβ相關結合蛋白(抗原)Multi-class antibodies規(guī)格： 0.5mg
指環(huán)蟲屬通用PCR檢測試劑盒小鼠脂多糖(LPS)ELISA試劑盒 ，英文名： LPS ELISA Kit
腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體3(AIL-R3)ELISA檢測試劑盒Monkeytumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand3,AIL-R3ELISAKit 96T/48T
犬皮質酮/腎上腺酮(CO)免疫試劑盒 Canine Coicosterone,CO ELISA Kit
英文名稱HumanProinsulinELISAKit人胰島素原(PI)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
化大鼠腎上腺髓質素(AM)基因重組表達載體(pGEFP-AM)測序引物對2OD
Rathiston-H2bELISA試劑盒大鼠組蛋白H2b(histon-H2b)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。產品僅用于科研實驗
7.每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。
化工儀器網