您好, 歡迎來(lái)到化工儀器網(wǎng)
酶標(biāo)儀使用方法
閱讀：1645 發(fā)布時(shí)間：2018-4-24
作為微孔板比色計(jì)的酶標(biāo)儀，其基本功能不外乎一個(gè)比色測(cè)定，所不同的是在測(cè)定波長(zhǎng)范圍、吸光度范圍、光學(xué)系統(tǒng)、檢測(cè)速度、震板功能、溫度控制、定性和定量測(cè)定軟件功能等方面的差異，當(dāng)然全自動(dòng)酶免疫分析系統(tǒng)還具有自動(dòng)洗板、溫育、加樣等功能。在臨床實(shí)驗(yàn)室實(shí)際工作中，實(shí)驗(yàn)人員在使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定操作時(shí)，有時(shí)難免會(huì)對(duì)酶標(biāo)儀的一些性能指標(biāo)產(chǎn)生迷惑，甚至對(duì)酶標(biāo)儀的應(yīng)用產(chǎn)生錯(cuò)誤的理解。如諸如使用酶標(biāo)儀較用肉眼觀察測(cè)定的陽(yáng)性率明顯增加這樣的問題。
一、 測(cè)定波長(zhǎng)目前國(guó)內(nèi)常見的ELISA試劑盒所使用的標(biāo)記用酶均為辣根過氧化物酶（HRP），底物通常為四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和鄰苯二胺（OPD），其在過氧化氫溶液的存在下，經(jīng)HRP作用，分別氧化為2,2,-二氨基偶氮苯（DAB）和聯(lián)苯醌。當(dāng)pH值為5.0左右時(shí)，DAB在450nm波長(zhǎng)處有zui大吸收，當(dāng)pH值降為L(zhǎng) 0時(shí)，zui大吸收波長(zhǎng)移至492 nm,同時(shí)摩爾消光系數(shù)變大，顯色加深，因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)。TMB的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長(zhǎng)450nm處有zui大消光系數(shù)，如果HRP量少，H:O:和TMB過量時(shí)，則形成藍(lán)色的陽(yáng)離子根。降低pH,即可使藍(lán)色的陽(yáng)離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌，使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min.因此，450nm和492 nm兩個(gè)波長(zhǎng)是目前ELISA測(cè)定zui常用的。各種酶標(biāo)儀都配有放置濾光片的可自動(dòng)轉(zhuǎn)換的部件，可以同時(shí)安裝6~8片濾光片，所配備的濾光片均應(yīng)包括上述兩個(gè)波長(zhǎng)，有的酶標(biāo)儀以490nm濾光片替代492nm濾光片，影響不大 一般酶標(biāo)儀的測(cè)定波長(zhǎng)在400~750nm或800nm之間，*可以滿足ELISA的顯色測(cè)定。。除了這兩個(gè)基本濾光片外，考慮到雙波長(zhǎng)比色的需要，還應(yīng)有620nm或630nm或650nm和405nm波長(zhǎng)的濾光片，其他濾光片可根據(jù)自己的需要。有時(shí)，有的實(shí)驗(yàn)室希望用酶標(biāo)儀作微量生化測(cè)定，故酶標(biāo)儀生產(chǎn)廠家對(duì)其生產(chǎn)的酶標(biāo)儀擴(kuò)展了紫外檢測(cè)功能，此時(shí)需要一個(gè)340nm波長(zhǎng)濾光片。此時(shí)，酶標(biāo)儀的測(cè)定波長(zhǎng)范圍就成為340-750nm或800nm。酶標(biāo)儀有單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)檢測(cè)功能有時(shí)使用者不知在什么情況下使用單或雙波長(zhǎng)檢測(cè)。所謂的“單波長(zhǎng)”就是使用一種對(duì)顯色具zui大吸收的波長(zhǎng)即450 nm或492 nm進(jìn)行比色測(cè)定；而“雙波長(zhǎng)”則除了用對(duì)顯色具zui大吸收的波長(zhǎng)即450 nm或492 nm進(jìn)行比色測(cè)定外，同時(shí)用對(duì)特異顯色不敏感的波長(zhǎng)如630 nm進(jìn)行測(cè)定，酶標(biāo)儀zui后打印出來(lái)的吸光度則為二者之差。630 nm波長(zhǎng)下得到的吸光度是非特異的，來(lái)自于板子上諸如指紋、灰塵、臟物等所致的吸收。因此，在ELISA比色測(cè)定中，使用雙波長(zhǎng)，且不必設(shè)空白孔。
二、測(cè)定的吸光度范圍 通常，酶標(biāo)儀的吸光度測(cè)定范圍在。0-2.5之間即可以滿足ELISA的測(cè)定要求。早期的酶標(biāo)儀可測(cè)定的吸光度一般在0-2.5之間，但現(xiàn)在基本上都做了拓寬，可達(dá)到3.5以上，并且能保持很好的精密度與線性。如Labsystems公司Dragon Wellscan MK-2的吸光度測(cè)定范圍為0-3.5，而Multiskan Ascent的吸光度測(cè)定范圍（Abs）達(dá)0-4.0，在0-4.0范圍，線性誤差不超過±2.0%，在0.3-3.0吸光度范圍內(nèi)，測(cè)定精密度CV小于±0.2%；3.0-4.0 Abs范圍內(nèi)，測(cè)定精密度CV小于士0.2%。因此，對(duì)于酶標(biāo)儀的吸光度范圍不必去刻意追求大的吸光度范圍，主要要看在一定的吸光度范圍內(nèi)的線性和精密度如何。
三、光學(xué)系統(tǒng) 酶標(biāo)儀的光學(xué)系統(tǒng)采用的是垂直光路多通道（通常為8或12通道，亦有單通道）檢測(cè)，一般為硅光管或光導(dǎo)纖維，除測(cè)定通道外，有的酶標(biāo)儀還有一個(gè)參比通道，每次測(cè)定可進(jìn)行自我校準(zhǔn)。酶標(biāo)儀的光學(xué)系統(tǒng)功能如何，均可通過酶標(biāo)儀測(cè)定的吸光度范圍、線性度、精密度和準(zhǔn)確度等體現(xiàn)出來(lái)。光學(xué)系統(tǒng)好的話，則上述指標(biāo)也應(yīng)較佳。測(cè)定的精密度與測(cè)定通道之間的均一性有直接關(guān)系。單通道可避免因通道不同所致的差異。