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Stbl3 Chemically Competent Cell    

基因型：

F- mcrB mrr hsdS20(rB-, mB-) recA13 supE44 ara14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20(StrR) xyl-5λ-leu mtl-1 endA1+

簡要說明：

Stbl3菌株來源于 HB101 E. coli strain，是慢病毒載體系統(tǒng)推薦使用的菌株。基因組含有重組酶recA13突變，可有效抑制長片段末端重復區(qū)的重組，降低錯誤重組的概率；但不含核酸酶endA1突變，體內(nèi)核酸酶含量較高，提取質(zhì)粒時務(wù)必使用質(zhì)粒提取試劑盒中去蛋白液。此菌株具有LIAN霉素抗性，不存在lacIqZΔM15，不可用于藍、白斑篩選。 

High5TM系列Stbl3感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，經(jīng)pUC19檢測轉(zhuǎn)化效率>108cfu/μg DNA

操作說明：

1.Stbl3感受態(tài)細胞放置冰中融化（或放手心或室溫片刻，待菌體處于冰水混合狀態(tài)時迅速插入冰中），加入目的DNA（質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物）并用手打EP管底輕輕混勻，冰上靜置25分鐘。 

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率。 

3.向離心管中加入0.9 mL 室溫 S.O.C. 培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基（推薦使用SOC培養(yǎng)基，可提高轉(zhuǎn)化效率）。

4.30℃，225 rpm復蘇90分鐘。 （當質(zhì)粒中含有不穩(wěn)定片段時， 30℃培養(yǎng)可降低錯誤重組的概率，若轉(zhuǎn)化control PUC19計算轉(zhuǎn)化效率，則需37℃， 225 rpm復蘇60分鐘。） 

5.5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C. 培養(yǎng)基上。 

6.將平板倒置放于30℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。（若轉(zhuǎn)化controlPUC19 計算轉(zhuǎn)化效率，則需37℃培養(yǎng)過夜）

注意事項：

1.對不穩(wěn)定DNA片段的克隆或逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒載體的構(gòu)建，涂板后平板應(yīng)在30℃培養(yǎng)，以減少發(fā)生錯誤重組的概率。 

2.制備高純度病毒質(zhì)粒時，應(yīng)使用新鮮轉(zhuǎn)化的平板接菌，新鮮菌液提取質(zhì)粒，菌液不可低溫保存后使用。 

3.對不穩(wěn)定的克隆或病毒質(zhì)粒優(yōu)先以質(zhì)粒狀態(tài)保存，盡量避免將質(zhì)粒保存在大腸桿菌細胞中。 

4.S.O.C.或LB培養(yǎng)基均可使用，S.O.C.可提高轉(zhuǎn)化效率20%；實驗人員可選擇在37℃或30℃培養(yǎng)細胞，37℃條件下，菌生長速度加快，有利于提高質(zhì)粒產(chǎn)量，30℃培養(yǎng)可降低錯誤重組概率。 

5.感受態(tài)細胞最好在冰中緩慢融化。插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉(zhuǎn)化效率?；烊肽康腄NA時應(yīng)輕柔操作。 

6.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒或高效率的連接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。