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SURE Chemically Competent Cell

基因型：

E.coli B e14-(McrA-) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1gyrA96 thi-1 supE44 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5(Kanr) uvrC [F′ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (TetR)].

簡要說明：

真核生物DNA存在較多“十字型"、“Z字型"等二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，這種DNA結(jié)構(gòu)在利用傳統(tǒng)大腸桿菌進(jìn)行克隆時(shí)易被大腸桿菌體內(nèi)的重組酶系統(tǒng)或其他防御系統(tǒng)識(shí)別并對(duì)其進(jìn)行重組，刪除等破壞，導(dǎo)致很難對(duì)這類DNA進(jìn)行正確的克隆操作。SURE菌株可以解決這些問題：此菌株體內(nèi)重組酶系統(tǒng)整條通路被破壞，并且(McrA-, McrCB-, McrF-, Mrr-, HsdR-) 這些限制性突變的存在賦予此菌株無法對(duì)外源DNA進(jìn)行標(biāo)記、限制的能力，提高了外源甲基化DNA的克隆效率，同時(shí)具有核酸酶(endA)突變、重組酶 (recB recJ)突變，增強(qiáng)了外源DNA的穩(wěn)定性。存在于F′因子上的lacIqZΔM15基因使此菌株可以進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；Kanr，Tetr賦予菌株KA那霉素和四環(huán)素抗性。High5TM系列SURE感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作，經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率達(dá)5×108cfu/μg。

操作說明：

1.SURE感受態(tài)細(xì)胞放置冰中融化，加入目的DNA（質(zhì)粒或連接產(chǎn)物）并用手輕輕打EP管底輕輕混勻，冰上靜置25分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3.向離心管中加入700μl不含抗生素的2YT或LB無菌培養(yǎng)基，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

4.5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)：

1.感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。

2.混入質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物時(shí)應(yīng)輕柔操作。

3.操作過程中勿將感受態(tài)暴露于氧化性環(huán)境中，例如超凈臺(tái)應(yīng)將臭氧排凈后再使用。

4.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?；蚋咝实倪B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

5. 此菌株具有KA 那霉素，四環(huán)素抗性，擁有這兩種抗性的質(zhì)粒無法使用；對(duì)<40 µg/mlLU霉素有抗性，但對(duì)100µg/mlLU霉素敏感。使用其他抗生素參考濃度：氨芐QIN霉素（終濃度： 100 µg/ml），LU霉素（終濃度：100 µg/ml）。

6.High5TM系列SURE感受態(tài)細(xì)胞采用常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)5×108cfu/μg。 ；如果有更高要求，可嘗試Stratagene公司推薦的標(biāo)準(zhǔn)protocol。