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293T/17 人胚腎細(xì)胞  STR鑒定

細(xì)胞介紹

293T/17細(xì)胞株是293T (293tsA1609neo)細(xì)胞株的衍生株。 293T 是293細(xì)胞株插入了SV40 T-antigen的溫度敏感基因形成的高轉(zhuǎn)衍生株。 293T細(xì)胞進(jìn)行克隆，檢測pBND和pZAP載體，得到一株能生成高滴度感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的衍生株，293T/17。 細(xì)胞持續(xù)表達(dá)猿病毒40(SV40)大T抗原，而因其高轉(zhuǎn)染能力篩選到17號克隆。 293T/17細(xì)胞用pCRIPenv-和pCRIPgag-2載體轉(zhuǎn)染得到ANJOU 65 細(xì)胞株。 ANJOU 65細(xì)胞再用pCRIPgag-2 和 pGPT2E載體轉(zhuǎn)染得到親宅性外殼表達(dá)細(xì)胞株BOSC 23。ANJOU 65細(xì)胞用攜帶gpt抗性基因的pCRIPAMgag載體轉(zhuǎn)染得到Bing 雙向性表達(dá)包裝細(xì)胞株。

細(xì)胞特性

1） 來源：人 胚胎腎臟

2） 形態(tài)：上皮樣細(xì)胞  貼壁生長

3） 含量：>1x106  細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用。

運輸和保存

干冰運輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

細(xì)胞接收后的處理

1）收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請拍照后及時聯(lián)系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完quan培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長密度達(dá)70%-80%以上，可以對細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細(xì)胞需要離心回收。

4）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完quan培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。  收到細(xì)胞后一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。

293T/17 人胚腎細(xì)胞  STR鑒定              

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備

1）準(zhǔn)備DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%； 雙抗 1%,  建議在wan全培養(yǎng)基中添加（L-谷an酰胺（2mM）1%；NEAA  1% ）。

注意：

1.該細(xì)胞貼壁能力較弱，培養(yǎng)時可酌情使用預(yù)鋪0.2%明膠的培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿。在運輸過程中，細(xì)胞會漂浮聚團(tuán)生長，收到細(xì)胞時同時收集懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞離心重懸后傳代培養(yǎng)。

2.如果發(fā)生293T/17細(xì)胞不貼壁，漂浮在培養(yǎng)基中的現(xiàn)象，可以酌情在培養(yǎng)基中添加（L-谷an酰胺（2mM）1%；NEAA  1% ）以便正確緩沖培養(yǎng)基。促使懸浮細(xì)胞更好的存活以及細(xì)胞更容易貼壁。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二．細(xì)胞處理：

1） 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完quan培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完quan培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完quan培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

該細(xì)胞貼壁能力較弱(半貼壁半懸?。┘?xì)胞，，傳代可以參考以下方法：

1. 收集：將培養(yǎng)瓶中的懸浮的細(xì)胞收集到離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。由于細(xì)胞貼壁不牢PBS潤洗后細(xì)胞會脫落所以PBS也要回收到離心管中。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白mei、-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3. 將收集到的懸浮細(xì)胞、pbs清洗液中的細(xì)胞和消化下來的貼壁細(xì)胞以1000rpml離心5min，棄去上清，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實驗使用。

下面T25瓶為例；

1. 細(xì)胞凍存時按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10^6~1×107個活細(xì)胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×10^6~1×107個活細(xì)胞/ml分配到一個凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。