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Allegro高通量靶向SNP組測(cè)序技術(shù)助力野生動(dòng)物基因分型
在野生動(dòng)物的研究中，應(yīng)用基因組學(xué)技術(shù)的主要困難之一是常規(guī)采集微量或非創(chuàng)傷性樣本，這些樣本通常會(huì)發(fā)生降解片段化、含量極低或有環(huán)境或食糜的外源 DNA 污染的情況發(fā)生。在野生動(dòng)物采樣場(chǎng)景中，糞樣是相對(duì)較容易采集的，特別適合避免在接觸動(dòng)物有危險(xiǎn)性的情況下進(jìn)行采樣。以往，由于缺乏靈活且經(jīng)濟(jì)的技術(shù)手段，使得對(duì)糞便樣本的基因組分析受到限制。
在過去的幾十年里，微衛(wèi)星（SSR）分析是野生動(dòng)物遺傳學(xué)基因分型的傳統(tǒng)技術(shù)。雖然微衛(wèi)星分析仍被廣泛使用，但微衛(wèi)星分析正迅速被單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 分析所取代，因?yàn)?/span>單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 在整個(gè)基因組中更為豐富，并且更適合于自動(dòng)化的高通量基因分型。高通量的SNP組已通過基因芯片的方式廣泛用于人類和農(nóng)業(yè)物種的研究。 然而，高通量 SNP 基因芯片的高昂開發(fā)成本限制了它們?cè)谝吧鷦?dòng)物研究中的使用，僅限于少數(shù)物種。 SNP 基因芯片也不適用于微量樣本，因?yàn)樗鼈兺ǔＰ枰罅?/span> DNA。
高通量測(cè)序基因分型 (GBS) 技術(shù)規(guī)避了基因芯片開發(fā)成本高的問題，但酶切位點(diǎn)序列的隨機(jī)分布阻止了靶向測(cè)序特定位點(diǎn)，而且大多數(shù)高通量測(cè)序基因分型 (GBS)技術(shù)還需要模板 DNA的起始量高于實(shí)際的微量樣本，例如糞便樣本。
隨著基因芯片和 GBS高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，高通量靶向SNP組測(cè)序方法已成為從全基因組序列中獲得基因型數(shù)據(jù)的可行替代方案。 高通量靶向SNP組測(cè)序可大致分為1）探針序列捕獲方法，其中探針被設(shè)計(jì)為捕獲 DNA 的誘餌，或2）通過 PCR 方法，其中探針被設(shè)計(jì)用于目標(biāo)序列擴(kuò)增。 高通量靶向SNP組測(cè)序?qū)崿F(xiàn)了微量DNA模板的目標(biāo)SNP位點(diǎn)的高覆蓋率和低測(cè)序成本。 因此， 高通量靶向SNP組測(cè)序有望將野生動(dòng)物遺傳學(xué)領(lǐng)域引入基因組學(xué)研究。
最近，一種Allegro的新型高通量SNP組靶向測(cè)序試劑已顯示出成本低、測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量高和通量高的基因分型優(yōu)勢(shì)。 該試劑通過單引物富集技術(shù) (SPET)，可以在單個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行1k – 100k + 目標(biāo)位點(diǎn)的多重目標(biāo)序列的富集，推薦的最小 DNA起始量為 10ng。 單引物擴(kuò)增減少了引物二聚體的出現(xiàn)，對(duì)SNP靶位點(diǎn)的高特異性進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)之間的可重復(fù)性。 與基因芯片相比，這種方法很靈活，允許對(duì)相對(duì)少量的樣本（目前為 192 個(gè)的試劑包裝）進(jìn)行快速定制分析設(shè)計(jì)。單引物富集技術(shù) (SPET)起初用于人類醫(yī)學(xué)，然后用于植物遺傳學(xué)，包括黑楊和玉米、番茄和茄子、棕櫚油和加那利群島的瀕危植物，但它在野生動(dòng)物中的使用仍然有限。
在大型哺乳動(dòng)物中，糞便通常是最容易獲得的用于基因分型的樣本組織。 值得注意的是，馬科動(dòng)物的糞便中積累大量上皮細(xì)胞沉積物，從而使得從黏膜表面采樣宿主DNA提供了可能。
日前，加拿大科學(xué)家報(bào)道了使用Allegro高通量SNP組靶向測(cè)序試劑從野馬糞便拭子中分離的DNA生成全基因組 SNP 數(shù)據(jù)的研究。作為加拿大某省野馬長(zhǎng)期研究的一部分，分別使用 dsDNA 熒光和宿主特異性 qPCR 測(cè)定法對(duì)收集的 989 份樣品的總DNA和宿主特異性 DNA進(jìn)行了定量。使用針對(duì) 279個(gè)SNP的定制SNP組探針對(duì)代表 44個(gè)個(gè)體的 48個(gè)樣本進(jìn)行了基因分型，這些樣本至少含有 10ng 的宿主 DNA。通過將 Allegro高通量SNP組靶向測(cè)序基因型與從具有SNP基因芯片的相同個(gè)體和來自同一匹馬的多個(gè)樣本中獲得的基因型進(jìn)行對(duì)比，分別評(píng)估了基因分型的準(zhǔn)確性和一致性。 62% 的拭子產(chǎn)生了可用于Allegro高通量SNP組靶向測(cè)序技術(shù)的起始宿主DNA 量。忽略未能擴(kuò)增的樣本，Allegro高通量SNP組靶向測(cè)序試劑對(duì)每個(gè)樣本平均恢復(fù)了 86.7% 的目標(biāo)SNP位點(diǎn)，而Allegro高通量SNP組靶向測(cè)序技術(shù)和 基因芯片之間的基因型一致性為 98.5%。來自同一個(gè)體的基因型的重復(fù)性接近統(tǒng)一，平均為 99.9%。該研究表明Allegro高通量SNP組靶向測(cè)序試劑適用于全基因組、微量DNA樣本的靶向 SNP 基因分型，并將促進(jìn)馬科動(dòng)物和相關(guān)物種的進(jìn)一步生態(tài)和保護(hù)遺傳學(xué)研究。