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在過去的 20 年里，遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微鏡已經(jīng)跨越了以阿貝衍射極限為代表的一度難以逾越的分辨率障礙 ，開發(fā)多種成功的方法，如受激發(fā)射損耗(STED) 、單分子定位方法(PALM 和 STORM) ，結(jié)構(gòu)照明顯微術(shù)(SIM)和超分辨率光學(xué)波動(dòng)成像(SOFI)，這要?dú)w功于圖像傳感器技術(shù)的改進(jìn)以及單分子光譜學(xué)的巨大進(jìn)步。

在這里，我們提出了一種新的顯微技術(shù)，它利用 SPAD23陣列探測(cè)器的超高時(shí)間分辨率來(lái)測(cè)量熒光波動(dòng)引起的相關(guān)性。在 ISM 架構(gòu)中測(cè)量的這種相關(guān)性，然后被用作具有高達(dá) 4倍增強(qiáng)橫向分辨率和增強(qiáng)軸向分辨率的超分辨率圖像的對(duì)比度。僅用幾毫秒的像素駐留時(shí)間就可以獲得高信噪比的超分辨率圖像。

單光子探測(cè)器陣列SPAD23技術(shù)源于代爾夫特理工大學(xué)和洛桑聯(lián)邦理工學(xué)院 7 年的研究工作和 6 項(xiàng)du特技術(shù)。它是由23個(gè)六角形封裝的單光子雪崩二極管組成的探測(cè)器陣列(SPADs)，具有更高的靈敏度和更低的噪聲。這款單光子探測(cè)器陣列SPAD23在其寬探測(cè)譜段內(nèi)擁有>50%的探測(cè)效率，<100cps的暗計(jì)數(shù)水平，且因其du特的半導(dǎo)體工藝及設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了qian所wei有的填充因子＞80%。這款帶有時(shí)間標(biāo)記功能（Time Tagging）的SPAD23整體尺寸只有xin用卡大小，是熒光顯微和量子信息領(lǐng)域的理想探測(cè)工具。

得益于SPAD23單光子陣列探測(cè)器的優(yōu)異性能，在與共聚焦顯微鏡搭配使用的過程中，增加了光的收集，最終獲得了更清晰、更明亮的圖像，其中還包含有關(guān)潛在分子功能、相互作用和環(huán)境的功能信息。

下圖提出了一種超分辨光學(xué)起伏圖像掃描顯微術(shù)的方案；設(shè)置在標(biāo)準(zhǔn)共焦顯微鏡的圖像平面中的針孔和單像素檢測(cè)器被替換為 23 像素的 SPAD 陣列，SPAD23單光子陣列探測(cè)器，增加了光線收集，提高了成像速度，減少了背景噪音，能夠在共聚焦顯微鏡中實(shí)現(xiàn)波動(dòng)對(duì)比度的超分辨率。

當(dāng)掃描樣品臺(tái)時(shí)，每個(gè)光子的檢測(cè)時(shí)間記錄在相連的 FPGA 電路中，并以數(shù)字形式存儲(chǔ)。然后分析該數(shù)據(jù)，為陣列中的每個(gè)像素對(duì)產(chǎn)生第二個(gè)相關(guān)圖像，產(chǎn)生 232 個(gè)分辨率增強(qiáng)為 2 的相關(guān)圖像。如下圖b所示分辨率的提高可歸因于兩個(gè)因素。首先，如在 ISM 中一樣，每個(gè)小探測(cè)器的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)(PSF)是激發(fā)和其探測(cè) PSF 的乘積。此外，從兩個(gè)這樣的 ISM PSFs 相乘得到的相關(guān)對(duì)比度實(shí)現(xiàn)了進(jìn)一步的變窄。在對(duì)圖像進(jìn)行適當(dāng)?shù)囊苿?dòng)以使其相互重疊之后，這一過程被稱為像素重新分配，我們?cè)诳臻g頻率域中應(yīng)用傅立葉重新加權(quán)濾波的最后階段。理論上，最終 SOFISM 圖像的 PSF 具有超過衍射極限 4 倍的橫向分辨率增強(qiáng)。

圖C 展示了 SOFISM，對(duì)相對(duì)稀疏的單個(gè) CdSe/CdS/ZnS核/殼/殼量子點(diǎn)(QDs)的樣品進(jìn)行成像。除了由于衍射造成的模糊之外，標(biāo)準(zhǔn)的共焦圖像(CLSM)包含大量的噪聲，這是由于量子點(diǎn)的發(fā)射強(qiáng)度在亮和暗狀態(tài)(閃爍)之間的波動(dòng)造成的。生成標(biāo)準(zhǔn) ISM 圖像的分辨率提高了 2 倍，同時(shí)噪聲水平明顯降低，通過像素重新分配達(dá)到平均水平。或者，通過計(jì)算熒光信號(hào)的二階相關(guān)矩陣，然后重復(fù) ISM 過程的剩余部分(像素重新分配和傅立葉重新加權(quán)),產(chǎn)生分辨率提高 2.5 倍的更清晰的圖像。我們注意到，這個(gè)數(shù)字低于理論預(yù)測(cè)的數(shù)字，可能是由于探測(cè)器的有限尺寸、樣品振動(dòng)和其他技術(shù)方面的原因。

最后，還可以生成互相關(guān)階數(shù)高于 2 的 SOFISM 圖像；上圖C 展示了來(lái)自相同場(chǎng)景的 4 階相關(guān)圖像，產(chǎn)生橫向分辨率的 4倍增 強(qiáng)。 在類似的實(shí)驗(yàn)條件下，盡管檢測(cè)方案有些麻煩，SOFISM 已經(jīng)被證明在軸向分辨率上提供了 2 倍的改進(jìn)，雖然一些成熟的超分辨率技術(shù)已經(jīng)被生命科學(xué)研究團(tuán)體采用并取得了巨大成功，但是 SPAD 陣列技術(shù)的最新進(jìn)展為可以針對(duì)特定需求提供超分辨率解決方案。SOFISM 可以提供一種實(shí)驗(yàn)上簡(jiǎn)單的方法，在合理的曝光時(shí)間內(nèi)提供顯著的 3D 分辨率增強(qiáng)，并且沒有顯著的實(shí)驗(yàn)復(fù)雜性。

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