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不看此文，別貿(mào)然開始ELISA實驗
閱讀：363 發(fā)布時間：2018-7-10酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）可以：（1）免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位；（2）研究抗酶抗體的合成；（3）顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)；（4）定量檢測體液中抗原或抗體成份。
實驗原理
雙抗體夾心法（常用于測定抗原）
用特異性抗體包被于固相載體，經(jīng)洗滌后加入含有抗原之待測樣品，如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結(jié)合，經(jīng)保溫孵育洗滌后，即可加入酶標(biāo)記特異性抗體，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進(jìn)行測定，底物降解的量即為欲測抗原的量。
實驗步驟
一、材料準(zhǔn)備
1. 實驗材料：血清、血漿、體液
2. 實驗儀器：酶標(biāo)比色計、96 孔板、移液槍、離心管、離心管盒
3. 所需試劑及試劑盒：碳酸鹽包被緩沖液、抗體球蛋白、吐溫-20、檸檬酸、硫酸
二、實驗操作
1. 包被抗體：用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至適濃度（1～10 μg /ml），每凹孔加 0.3 ml，4℃ 過夜，或 37℃ 水浴 3 小時，貯存冰箱。
2. 洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含 0.05% 吐溫-20）洗 3 次，每次 5 分鐘。
3. 每凹孔加入 0.2 ml 用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的被檢標(biāo)本，37℃ 作用 1～2 小時。
4. 洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含 0.05% 吐溫-20）洗 3 次，每次 5 分鐘。
5. 加入 0.2 ml 用稀釋緩沖液稀釋的酶標(biāo)記特異性抗體溶液，37℃ 作用 1～2 小時或由預(yù)試實驗確定作用時間。
6. 洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含 0.05% 吐溫-20）洗 3 次，每次 5 分鐘。
7. 加入 0.2 ml 底物溶液于每個凹孔（OPD 或 OT），室溫作用 30 分鐘（另作一空白對照，0.4 ml 底物加 0.1 ml 終止劑）。
8. 加終止劑：每凹孔加 2M H2SO4 或 2 M 檸檬酸 0.05 ml。
9. 觀察記錄結(jié)果：目測或用酶標(biāo)比色計測定（OPD 用 492 nm）OD 值。
ELISA 的影響因素
1. 固相載體
可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進(jìn)行酶標(biāo)記測定的基本條件。許多物質(zhì)可作為固相載體，但在 ELISA 中常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板及塑料管。
每批制品在使用前，須經(jīng)過實驗室鑒定，鑒定的方法和標(biāo)準(zhǔn)是對每批購置的微量反應(yīng)板或塑料管抽樣，用 0.2 ug / ml 純化的正常人 IgG 進(jìn)行包被，經(jīng)洗滌后加酶標(biāo)記抗人球蛋白進(jìn)行反應(yīng)，再經(jīng)孵育洗滌，加底物顯色終止反應(yīng)后，逐孔在酶標(biāo)比色計中測定其消光值、光密度（OD 值）。
一般認(rèn)為全板中每兩孔間 OD 值的誤差不超過 10% 為合格。如果中間孔與四周孔 OD 值相差太大，或者反應(yīng)板的這一邊與另一邊凹孔的 OD 值相差大，均不合格。此外，還要檢查陽性和陰性參考血清 OD 值是否有明顯差別。一般要求有 10 倍左右的差異為合格。
2. 抗原
在 ELISA 中，包被于固相載體表面的抗原或抗體的來源和制備方法對試驗結(jié)果都有影響。包被所用的抗原必須是可溶性的，且要求是和穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。而且抗原包被固相載體除濃度外，對時間、溫度、PH 均有關(guān)系。
溫度高（如 37℃、45℃、或 56℃），包被時間可縮短，溫度低可延長包被時間。但為了方便起見，通常采用 4℃ 包被過夜，可使抗原吸附得更加*且均勻。
在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應(yīng)板或塑料管作固相載體時，在堿性條件下（如 0.1 mol/L、PH 9.6 碳酸鹽緩沖液稀釋抗原）4℃ 包被過夜較為合適。
但在某些試驗中，如用 LPS 或毒素蛋白包被時，用 PH 7.2～7.4 PBS 稀釋才是滿意的。包被特異蛋白質(zhì)的濃度為 1～10 ug/ml，而對某些病原微生物抗原以 5～20 ug/ml 較為合適，但均應(yīng)通過滴定。