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皮層／海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
閱讀：827 發(fā)布時(shí)間：2018-12-14皮層／海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)方法原理
神經(jīng)元在發(fā)育過程中早于膠質(zhì)細(xì)胞，因此通常選擇胎鼠做腦內(nèi)神經(jīng)元培養(yǎng)。一般取El7-l8d孕大鼠或El4-16d孕小鼠做神經(jīng)元培養(yǎng)。新生1d的仔鼠也可以用來培養(yǎng)神經(jīng)元，但培養(yǎng)成功后雜細(xì)胞較多，有時(shí)需要進(jìn)一步純化。這兩個(gè)部位的細(xì)胞培養(yǎng)方法類似
實(shí)驗(yàn)材料 El7-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠新生Id的仔鼠
試劑、試劑盒 含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基神經(jīng)元維持培養(yǎng)基(Neurobasal+B27+谷氨酰胺）
儀器、耗材 培養(yǎng)瓶
實(shí)驗(yàn)步驟
1.根據(jù)離心前細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果，先用少量神經(jīng)元維持培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，充分重懸后，補(bǔ)加液體至合適體積，按照(2-4)x104/cm2的密度在培養(yǎng)板、玻片等介質(zhì)上接種細(xì)胞，并置于37℃孵箱培養(yǎng)。
2.培養(yǎng)過程中接觸細(xì)胞要注意動(dòng)作輕柔，接種Id后應(yīng)避免把細(xì)胞從孵箱中拿出，可根據(jù)培養(yǎng)液的顏色和亮度觀察污染情況（污染的細(xì)胞，培養(yǎng)液混濁、發(fā)黃；正常應(yīng)該是清亮透明的）。3d后1/3量換液，并可利用神經(jīng)元標(biāo)志物的免疫化學(xué)染色鑒定純度。第5天起每隔2d 1/2量換液，并可以根據(jù)神經(jīng)元的成熟程度用于實(shí)驗(yàn)。
3.如果覺得神經(jīng)元純度達(dá)不到實(shí)驗(yàn)的要求，可以添加阿糖胞苷（終濃度為5µM),作用2d后，1/2量換液，逐漸去除。
培養(yǎng)成功的神經(jīng)元，無污染，相差顯微鏡下細(xì)胞折光性好，細(xì)胞碎片很少或沒有，突起長，培養(yǎng)基清亮，細(xì)胞有一定的間距，沒有成團(tuán)存在，分布均勻，而且沒有太多的雜細(xì)胞。培養(yǎng)不太好的細(xì)胞，雜細(xì)胞多，神經(jīng)元狀態(tài)一般或很差，細(xì)胞碎片較多
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注意事項(xiàng)
1.神經(jīng)元培養(yǎng)時(shí)常為1/2量換液，在換液前應(yīng)將培養(yǎng)液在37℃水浴鍋中充分復(fù)溫，冷刺激和全量換液刺激都會(huì)使細(xì)胞活力下降。
2.鼠齡越大，其神經(jīng)元的培養(yǎng)，操作越要輕柔精細(xì)，關(guān)鍵在于消化過程和吹打過程。消化時(shí)間、吹打次數(shù)對(duì)細(xì)胞活力的影響在原代培養(yǎng)中是大的。在保證可以獲得足夠單細(xì)胞懸液的前提下，應(yīng)適當(dāng)縮短操作時(shí)間和步驟。
3.海馬和皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)沒有大的區(qū)別，皮層細(xì)胞豐富，很容易收集細(xì)胞，但是雜細(xì)胞較多。
4.利用孕鼠做神經(jīng)元的培養(yǎng)，純度高于新生鼠，而且活力更好。培養(yǎng)海馬神經(jīng)元時(shí)，孕期不足，海馬尚未*形成，較難分離，但是取皮層就沒關(guān)系了。
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其他
實(shí)驗(yàn)心得：
1.應(yīng)用阿糖胞甘作用于神經(jīng)元，細(xì)胞純度會(huì)高一些。1/2量換液去除時(shí)，雖然會(huì)存在殘留，但是這樣的濃度對(duì)神經(jīng)元活性的作用基本可以忽略。
2.在包被玻片時(shí)，習(xí)慣將8片玻片置于已加入2ml PLL的小皿中，一片一片的加，加完后用彎管小心吹勻，蓋上皿蓋后，輕輕震搖。再放入孵箱包被過夜。包被結(jié)束后，以無菌水漂洗2遍，并以彎攝一片一片的夾出來，置于已滅菌的紗布上，超凈臺(tái)內(nèi)吹干。
3.接種細(xì)胞爬片時(shí)，先以(2-4)X105/100µL的濃度配好單細(xì)胞懸液，在玻片上接種100µL,靜置20min后，移至培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2-3h后補(bǔ)液至400µL。這種方法接種的細(xì)胞能夠均勻分布于爬片上。
4.為了避免長時(shí)間培養(yǎng)出現(xiàn)培養(yǎng)液變干的情況，可以在培養(yǎng)板每孔之間的間隙加無菌水。