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125I-UdR釋放試驗測定NK細胞活性
閱讀：1001 發(fā)布時間：2019-2-25實驗方法原理 25I-UdR（125I-2′脫氧尿嘧啶核苷）是胸腺嘧啶核苷的類似物，作為DNA合成的前體物，能相當特異地取代胸腺嘧啶核苷摻入到細胞核DNA鏈上。因此，可用125I-UdR標記體外傳代培養(yǎng)的腫瘤細胞作為靶細胞，以外周血分離的單個核細胞或小鼠脾細胞作為效應細胞，進行體外NK細胞活性檢測。被效應細胞殺傷的靶細胞溶解后可釋放125 I-UdR，用γ-計數儀測定其放射性強度，以125I-UdR釋放百分率表示NK細胞的活性。
實驗材料 YAC-1細胞
試劑、試劑盒 125I-UdR（125I-2′脫氧尿嘧啶核苷）胰蛋白酶DNA酶5-氟脫氧尿嘧啶核苷RPMI-1640培養(yǎng)液
儀器、耗材 塑料試管γ-計數儀離心機
實驗步驟
一、材料
1. 125I-UdR ：125I的物理半壽期為59.7d。
2. 胰蛋白酶：用無Ca2+、Mg2+的Hanks液配制成3mg/ml，小量分裝，-20℃凍存。
3. DNA酶：用Hanks液配成50μg/ml，小量分裝，-20℃凍存。
4. 5-氟脫氧尿嘧啶核苷（5-FudR）用生理鹽水配制成1×10-3 mol/L，4℃冰箱保存。
5. 其余材料同上。
二、操作方法
1. 靶細胞的制備：取培養(yǎng)24～48h的靶細胞1ml（5×105 /ml），分別加入5-FudR 4～6μl和125I-UdR 6μCi，混勻，置37℃培養(yǎng)2h，取出后用含5%NCS的1640營養(yǎng)液洗滌3次，每次離心1500r/min，2min，后用*RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮，計數活細胞。用γ-計數儀檢測標記率，一般可達1～2cpm/細胞即可；
2. 效應細胞的制備：用常規(guī)方法分離PBMC或小鼠脾細胞，后用*RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮并計數；
3. 效-靶細胞作用：調整效應細胞和標記的靶細胞濃度，分別加入塑料試管中，效/靶細胞比例為100:1。同時設只加標記靶細胞的自然釋放對照管，每份標本和對照管均設3個復管，每管均用*RPMI-1640培養(yǎng)液補足體積至1ml，混勻，離心1500r/min，2min，以促進效-靶細胞作用，置37℃，5%CO2溫箱中培養(yǎng)18h。
4. 酶處理：取出效/靶細胞培養(yǎng)物，1500r/min離心2min，棄上清，于每管中加入胰蛋白酶和DNA酶各0.1ml，混勻后置37℃水浴30min，促使已受損傷的靶細胞釋放125I-UdR，然后于各管中加入0.8ml冷Hanks液，以終止酶反應。1500r/min離心2min，分別吸出各管上清0.5ml置于另一個塑料試管中。
5. 放射性測量和結果計算：用γ-計數儀分別測量每管上清和細胞部分的cpm值，并按下式計算125I-UdR釋放率和NK細胞活性，取三管均值作為NK細胞活性。
125 I-UdR釋放率（%）= （0.5ml上清cpm值×2）/（0.5ml上清cpm值+0.5ml細胞懸液cpm值）×100％
NK細胞活性（%） =試驗管125 I-UdR釋放率 - 對照管125 I-UdR自然釋放率。
一般要求125I-UdR自然釋放率<10％，檢測小鼠脾細胞NK活性用YAC-1細胞作為靶細胞時，檢測前可不經過酶處理。
收起
注意事項
1. 該標記法需要長時間的孵育，用酶處理可增加方法的敏感性。
2. 要獲得較理想的結果，關鍵在于對靶細胞標記前的代傳處理。使細胞處于對數增長期的活力狀態(tài)，以達到適的標記率和增強細胞對放射性同位素毒性作用的抗力，從而降低自然釋放。
3. 因為如果發(fā)生污染就要丟棄培養(yǎng)的細胞，重新開始。
其他
1. NK活性計算：
同位素釋放%（NK活性）=（實驗組cpm一自然釋放cpm）/（大釋放cpm一自然釋放cpm）X100
自然釋放%=（自然釋放cpm/大釋放cpm）x100
此結果中列出的同位素釋放%,即代表NK活性。
2. 目前常用鉻酸鈉（Na51cro4）及125I一脫氧尿嘧啶核苷（125I-UdR）標記祛，兩種方祛各有利弊。
51Cr優(yōu)點：敏感、簡便、流程短、重復性好，缺點為半衰期短、自然釋放高。
125I-UdR優(yōu)點：半衰期長、自然釋放低、適于孵育時間較長的實驗。缺點為敏感性較低、流程長。