質(zhì)粒名稱：pHyVec4

質(zhì)粒規(guī)格：2ug

實驗步驟:

1)質(zhì)粒提取

1.10,0001min離心收集1.5-5ml菌液沉淀于1.5ml離心管中

2.加入100溶液1,振蕩至*懸浮

3.加入200溶液2,立即輕柔顛側(cè)離心管6次,使菌體充分裂解,隨后將離心管冰上放置

3分鐘

4.加入150山溶液3,立即溫和顛倒離心管數(shù)次,冰上放置3分鐘,10,00g離心10mins

5.將步驟4的上清轉(zhuǎn)移至新的離心管(盡量去除雜質(zhì)),加入等體積的苯酚/氖仿/異成醇混

合均勻10,000離心5min

將步驟5的上清轉(zhuǎn)移至新的離心管,加入2倍體積的無水乙醇,室溫放置5-1omin,沉

降DNA

7.10000g離心10分鐘,棄乙醇,保留沉淀,加入1ml706的乙醇洗滌沉淀,10,000離

心5分鐘

8.倒掉乙醇溶液,用吸水紙吸凈管壁上的水珠,室溫蒸發(fā)痕量乙醇

9.加入適量含 Rnase的TE或滅菌雙蒸水溶解質(zhì)粒DNA

2)質(zhì)粒鑒定瓊脂糖礙膠電泳

灌膠:膠中加入芡光染料< SYBR Green)

加樣:質(zhì)粒+上樣緩沖液→混勻

電泳

結(jié)果觀察:UV燈下

pHyVec4實驗分析：

裂解細(xì)胞中除含有質(zhì)粒DNA外,還含有基因組DNA、各種RNA、蛋白質(zhì)和脂類等物質(zhì),因

用堿裂解法除去雜質(zhì)

1、防止DNA裂解: Solution1

1)、所含糖增加溶洨黏度,維持滲透壓,防止DNA受機械剪切作用降解

2)、所含EDTA抑制酶活性

2、溶解與變性: Solution2

1)強堿使質(zhì)粒DNA和染色體DNA變性