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那么在細(xì)胞凍存和復(fù)蘇實(shí)際操作過(guò)程中應(yīng)注意哪些事項(xiàng)呢？

1、凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。

2、DMSO應(yīng)過(guò)濾除菌，甘油用高壓消毒。

3、細(xì)胞懸液分裝凍存時(shí)要迅速，均勻。安瓿封口后先放入0.05‰美藍(lán)溶液中，使冷凍保護(hù)劑分布均衡，且可檢出有滲漏的壞安瓿。安瓿上貼上標(biāo)簽，作好記錄，包括細(xì)胞的種屬、來(lái)源、代數(shù)、凍存日期、數(shù)量、凍存位置、備注等。

4、細(xì)胞降溫應(yīng)逐步進(jìn)行，先以每分鐘降1～3℃的速度降至-30℃，再加速以15～30℃/分鐘降至-150℃，隨即迅速轉(zhuǎn)入液氮。

5、復(fù)蘇時(shí)，取出后立即放入37℃水浴中，搖動(dòng)安瓿，使其*恢復(fù)懸液狀態(tài)（20～60秒）。打開安瓿，將內(nèi)容物倒入至少10ml*培養(yǎng)基中，100g離心10分鐘。去上清液，加入新鮮培養(yǎng)液，混勻，培養(yǎng)。

6、吸取過(guò)營(yíng)養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼，因?yàn)闅埩粼谖茴^中的營(yíng)養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時(shí)會(huì)把有害物帶入營(yíng)養(yǎng)液中。

7、開啟、關(guān)閉長(zhǎng)有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶時(shí)，火焰滅菌時(shí)間要短，防止因溫度過(guò)高燒死細(xì)胞。

8、換液時(shí)傾倒廢液，瓶口不能接觸廢液缸，速度不能過(guò)快，防止廢液四濺。

9、吹打細(xì)胞時(shí)，要注意邊角的細(xì)胞是否吹打下來(lái)。

10、手或相對(duì)較臟的物品不能經(jīng)過(guò)開放的瓶口上，即不可以在開口容器上方操作。

11、每次操作只處理一株細(xì)胞，以免造成細(xì)胞交叉污染。

12、注意自身的安全，對(duì)于來(lái)自人源性或病毒感染的細(xì)胞株應(yīng)特別小心。操作過(guò)程中，應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑例如DMSO等。

13、從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但最好為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。